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快速高效判斷病毒活性,何懼“疫”軍突起

來(lái)源:珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司   2020年02月14日 10:42  

農(nóng)歷庚子年春節(jié),“疫”軍突起,新型冠狀病毒(2019-nCoV)肆虐中華大地,全國(guó)上下正在面臨一場(chǎng)疫情阻擊戰(zhàn)。醫(yī)務(wù)工作者日以繼夜救治病患,科研人員加班加點(diǎn)投入到抗擊新冠病毒的相關(guān)研究中。

在病毒學(xué)研究中,病毒空斑實(shí)驗(yàn)(virus plaque assay)將各稀釋度的病毒液接種到單層細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中,吸附2小時(shí)后,在單層細(xì)胞上覆以瓊脂糖,病毒感染細(xì)胞并在細(xì)胞中增殖,使細(xì)胞破裂死亡。由于固體介質(zhì)的限制,釋放的病毒只能由初感染的細(xì)胞向四周擴(kuò)展。經(jīng)過(guò)幾個(gè)增殖周期,便形成一個(gè)局限性病變細(xì)胞區(qū),即病毒空斑。理論上,當(dāng)病毒液充分稀釋后,獲得的每個(gè)空斑均源于初感染細(xì)胞的一個(gè)病毒顆粒??瞻邔?shí)驗(yàn)是病毒滴定,篩選病毒突變株,檢測(cè)病毒抗體和抗病毒藥物研究的常規(guī)手段。區(qū)別于傳統(tǒng)的只檢測(cè)病毒顆粒的PCR和免疫熒光方法,病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)有活性的感染性病毒顆粒,即空斑形成數(shù)(PFU)。

目前,病毒空斑實(shí)驗(yàn)主要還是通過(guò)人工計(jì)數(shù)的方式在6孔,12孔或24孔板里實(shí)現(xiàn)。這樣的操作速度慢,主觀因素大,出錯(cuò)率高;尤其當(dāng)病毒活性比較高時(shí),很難準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)出空斑數(shù)。

相比之下,利用成像配合自動(dòng)計(jì)數(shù)的方法可以提高病毒空斑的檢測(cè)通量,提升計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。如下圖所示,用AlexaFluor488染色的病毒進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn),在病毒空斑形成后通過(guò)明場(chǎng)成像和熒光成像,可以看到感染后病毒引起宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變,也稱為細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。這類效應(yīng)可能是或者細(xì)胞裂解導(dǎo)致單層(溶斑)出現(xiàn)孔洞(A),也可能是形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞脫離(非溶斑)(B)

 

利用模塊化的分析算法,計(jì)算機(jī)可以非常準(zhǔn)確地判斷出這兩種細(xì)胞病變狀態(tài)。如圖C中,紅色標(biāo)注的是溶斑空洞,而藍(lán)色的則是非溶斑的細(xì)胞脫離。

 

為了驗(yàn)證計(jì)算機(jī)分析的準(zhǔn)確性,研究人員進(jìn)行了人工計(jì)數(shù)和計(jì)算機(jī)分析的比對(duì)實(shí)驗(yàn)。將病毒按不同倍數(shù)進(jìn)行稀釋,進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)完成后,由3名分析人員進(jìn)行人工計(jì)數(shù),同時(shí)利用EnSight™多模式檢測(cè)儀進(jìn)行成像和空斑計(jì)數(shù)分析(下圖)。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:人工計(jì)數(shù)和自動(dòng)圖像分析都具有非常好的線性回歸,其R2值非常相似。但是當(dāng)病毒稀釋倍數(shù)很低(病毒濃度高)的時(shí)候,人工計(jì)數(shù)就很難實(shí)現(xiàn)了 ,如下圖中的1:201:10兩個(gè)病毒濃度點(diǎn)(圖D)。

 

從空斑計(jì)數(shù)結(jié)果看(圖E),第一次實(shí)驗(yàn)在人工可計(jì)數(shù)的病毒濃度下,計(jì)算機(jī)分析和人工計(jì)數(shù)值基本一值;但第二次實(shí)驗(yàn)中,在1:1601:640兩個(gè)病毒濃度下,2號(hào)分析人員明顯高估了空斑的個(gè)數(shù)。這也說(shuō)明人工計(jì)數(shù)存在一定的主觀性,具有計(jì)數(shù)值偏離真實(shí)值的風(fēng)險(xiǎn)。

以上實(shí)驗(yàn)是使用珀金埃爾默的EnSight™多模式檢測(cè)系統(tǒng)完成的。結(jié)果表明成像自動(dòng)分析可以顯著提升病毒空斑實(shí)驗(yàn)的通量以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

 

 

 

珀金埃爾默公司的EnSight™多模式檢測(cè)儀是一款集傳統(tǒng)酶標(biāo)技術(shù)和高速微孔成像于一體的系統(tǒng)。EnSight™成像模塊專為高速高效的細(xì)胞成像而設(shè)計(jì),采用先進(jìn)的sCMOS相機(jī)以降低信號(hào)背景噪音,激光自動(dòng)聚焦以快速成像,固態(tài)光源 (LED) 以進(jìn)行短時(shí)照明;配備高內(nèi)涵(HCS)圖像分析內(nèi)核的軟件Kaleido™,使圖像數(shù)據(jù)準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息。同時(shí),EnSight™的AlphaTR-FRET等模塊,可以在成像的同時(shí)檢測(cè)同一樣品中其他生化指標(biāo),讓研究變得多維度,讓科研人員對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有更好的把握。

 

掃描下方二維碼,即可下載珀金埃爾默EnSight™多模式檢測(cè)系統(tǒng)相關(guān)資料。

 

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