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caski-LUC 人子宮腺癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)步驟

來(lái)源:上海琛藝實(shí)業(yè)有限公司   2020年02月17日 11:50  


caski-LUC 人子宮腺癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)步驟               
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?轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過(guò)程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選 
1.質(zhì)粒部分
1.酶切載體:pGL4.10(luc2)由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷;EGFP和mCherry片段由PCR擴(kuò)增獲得700-800bp左右片段;pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。
2.電泳和膠回收:上述酶切產(chǎn)物DNA電泳,TAKARA試劑盒膠回收,回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。
3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體,連接使用20ul體系,25℃,10min。
4.轉(zhuǎn)化:感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后,加入連接產(chǎn)物,靜置25min后在水浴42℃,45sec熱休克,后加入250ul無(wú)抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h,將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過(guò)夜。
5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個(gè)單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中,255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。
6.小抽質(zhì)粒與鑒定:使用堿裂解法小抽,質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解;酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過(guò)酶切鑒定。
7.熒光素表達(dá)鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2(以下簡(jiǎn)稱Gluc)或pSin-hyg-mCherry/luc2(以下簡(jiǎn)稱Mluc) 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞:DNA定量后,使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染,試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水,其中一管加入1ug量的質(zhì)粒(DNA體積=1ug/DNA濃度),輕輕震蕩混勻,再輕微離心;在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻,輕微離心,然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中,室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi),37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng),8小時(shí)后換培養(yǎng)液。
8.報(bào)告基因檢測(cè):Passive Lysis Agent裂解細(xì)胞,加入熒光素酶作用底物,將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性,陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。
9.質(zhì)粒中抽:取1ml轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測(cè)正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜,使用Invitrogen試劑盒中抽,產(chǎn)物電泳鑒定,-20℃保存。
1.慢病毒包裝部分
1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天,293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90%,胰酶消化后,1:3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時(shí),細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80%。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。
2.提取病毒上清:轉(zhuǎn)染48-72hours后,將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下,3000rpm,離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。
3.濃縮病毒:將病毒上清用0.45um濾器過(guò)濾至濃縮離心管中,2000rpm,4℃,15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中,-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1),消化4T1細(xì)胞并計(jì)數(shù),將細(xì)胞鋪于24孔板中(以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度,37°C過(guò)夜孵化細(xì)胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液,并且制備1:2病毒稀釋液200µl加入細(xì)胞中。
3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml,晃勻孔板,37度孵化過(guò)夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基,加入500µl*培養(yǎng)基。
5.(Day4)換液,加入300µg/ml  Hygromycin(Sigma)來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
6.(Day4-7),每24h換液,300µg/ml Hygromycin(Sigma)來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
維持培養(yǎng)。
7.(Day8-12)細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。
8. Capan-2-GFP人胰腺癌細(xì)胞-綠色標(biāo)記 STR鑒定: 取5×104細(xì)胞,用Passive Lysis裂解液裂解,加入熒光素酶作用底物,將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性,陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。GFP和mCherry表達(dá)通過(guò)熒光顯微鏡觀察。
 
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 本公司細(xì)胞引種來(lái)源:ATCC、DSMZ、ECACC、武大細(xì)胞庫(kù)、上海生化細(xì)胞所、中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)等

 
細(xì)胞處理方法:
一、貼壁細(xì)胞
1、 接收到細(xì)胞,肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色,顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片,顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞 100X,200X 各一張)。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開外包裝。
3、嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)范,打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4、37度平衡1-2小時(shí)。
5、用移液管吸取培養(yǎng)基,到50ml離心管中,剩下細(xì)胞密度達(dá)到80%至90%可以傳代,如沒(méi)有達(dá)到添加6ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
6、如果肉眼檢查上清有細(xì)胞,對(duì)50ml上清進(jìn)行離心收集細(xì)胞,如果細(xì)胞連片狀態(tài),棄掉上清對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化(1ml胰酶37度),接種培養(yǎng)。
 
二、懸浮細(xì)胞
1、接收到細(xì)胞,肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色,顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片,顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞 100X,200X 各一張)。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開外包裝。
3、嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)范,打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4、細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出(嚴(yán)禁直接傾倒)。
5、1000rpm,5min 離心,用吸管小心吸出上清,加入培養(yǎng)基,重懸細(xì)胞。
6、將重懸好的細(xì)胞轉(zhuǎn)入六孔板或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶種,加入新鮮培養(yǎng)基,置于 37℃,5%CO2 培養(yǎng)(大部分細(xì)胞)。
 
培養(yǎng)操作:細(xì)胞培養(yǎng)操作指南
細(xì)胞常見問(wèn)題分析:細(xì)胞培養(yǎng)常見問(wèn)題分析
 
細(xì)胞在發(fā)貨前進(jìn)行質(zhì)檢:
1、細(xì)胞存種的活性檢測(cè)
2、細(xì)菌、真菌、霉菌污染物鏡檢
3、衣原體、支原體檢測(cè)(熒光法、培養(yǎng)法等)
 
產(chǎn)品質(zhì)量保證及售后:
1、 細(xì)胞為三代以內(nèi),活體。運(yùn)輸過(guò)程中細(xì)胞出現(xiàn)污染和狀態(tài)不好,我們*免費(fèi)重新發(fā)貨。
2、 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若確定是客戶問(wèn)題,客戶僅需支付物流和耗材費(fèi)用,我們可重新發(fā)貨。其他根據(jù)情況靈活處理。
3、 產(chǎn)品使用過(guò)程中,可提供技術(shù)上的指導(dǎo)。

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