CHO-LUC中國倉鼠卵巢細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記 培養(yǎng)步驟

慢病毒包裝部分
1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。

2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。

1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細(xì)胞并計數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細(xì)胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細(xì)胞中。

3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。

5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。

維持培養(yǎng)。

7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。

8. 4T1-Gluc/Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽性對照共同進(jìn)行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達(dá)通過熒光顯微鏡觀察。

•培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
•細(xì)胞傳代所需時間：1天/代
•篩選標(biāo)記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
•體外實驗數(shù)據(jù)：
1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：
2.細(xì)胞裂解液的發(fā)光值，數(shù)據(jù)—化學(xué)發(fā)光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。

SNU４２３細(xì)胞保藏平臺；細(xì)胞生長特性：貼壁；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書；細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

KCL22S細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：詳見相關(guān)文獻(xiàn)介紹;細(xì)胞傳代方法：１：２傳代;細(xì)胞生長特性：懸浮;細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書;相關(guān)細(xì)胞有：Stanford University-Diffuse Histiocytic Lymphoma-10細(xì)胞、SHG-44細(xì)胞、SK UT 1細(xì)胞

GM-3573細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：這是P３X６３Ag８(ATCCTIB-９)的一個不分泌克隆。Kappa鏈合成了但不分泌。能抗０.１mM８-氮雜鳥嘌呤但不能在HAT培養(yǎng)基中生長。據(jù)報道它是由于缺失了３-酮類固醇還原酶活性的膽固醇營養(yǎng)缺陷型。檢測表明肢骨發(fā)育畸形病毒(鼠痘)陰性。;細(xì)胞傳代方法：１：２傳代，３天內(nèi)可長滿。;細(xì)胞生長特性：懸浮生長;細(xì)胞形態(tài)特性：淋巴母細(xì)胞;相關(guān)細(xì)胞有：CCD18細(xì)胞、COLO-394細(xì)胞、CCRF-CEM C7細(xì)胞

CFPAC-1 Cells|人胰腺導(dǎo)管癌貼壁細(xì)胞

Okayama University Medical School-23細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：詳見相關(guān)文獻(xiàn)介紹;細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細(xì)胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細(xì)胞說明書部分;細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書;相關(guān)細(xì)胞有：OC-316細(xì)胞、H-2108細(xì)胞、ELD-1細(xì)胞

RC-4B/C細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：詳見相關(guān)文獻(xiàn)介紹;細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細(xì)胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細(xì)胞說明書部分;細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書;相關(guān)細(xì)胞有：SW-948細(xì)胞、BA/F3細(xì)胞、SK Mel28細(xì)胞

L5178YR細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：詳見相關(guān)文獻(xiàn)介紹;細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細(xì)胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細(xì)胞說明書部分;細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書;相關(guān)細(xì)胞有：D10細(xì)胞、L M (TK-)細(xì)胞、NCIH748細(xì)胞

Z138細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：詳見相關(guān)文獻(xiàn)介紹;細(xì)胞傳代方法：１：５-１：１５傳代；每周２-３次。;細(xì)胞生長特性：懸浮生長;細(xì)胞形態(tài)特性：淋巴母細(xì)胞;相關(guān)細(xì)胞有：NCI-H520細(xì)胞、HeLa 229細(xì)胞、KATOIII細(xì)胞

LS 1034細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：詳見相關(guān)文獻(xiàn)介紹;細(xì)胞傳代方法：１：３傳代，每周２-３次;細(xì)胞生長特性：貼壁生長;細(xì)胞形態(tài)特性：上皮細(xì)胞樣;相關(guān)細(xì)胞有：MNNG-HOS (TE 85, clone F-5)細(xì)胞、LY細(xì)胞、OVCA 433細(xì)胞

3T3 Swiss Albino細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：３T３細(xì)胞株是１９６２年Todaro G和Green H從分離的瑞士小鼠胚胎中建立的；該細(xì)胞的生長受接觸性抑制，匯合狀態(tài)的單層細(xì)胞密度為４００００個細(xì)胞/平方厘米；檢測結(jié)果顯示該細(xì)胞鼠痘病毒陰性；在中生長較好，在某些玻璃表面上可能狀態(tài)不佳；細(xì)胞生長飽和時其密度可以達(dá)到約５００００ cells/cm２。;細(xì)胞傳代方法：１：３傳代；３-４天１次。;細(xì)胞生長特性：貼壁生長;細(xì)胞形態(tài)特性：成纖維細(xì)胞樣;相關(guān)細(xì)胞有：OVTOKO細(xì)胞、BNL CL2細(xì)胞、CCK81細(xì)胞

COLO 699細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：詳見相關(guān)文獻(xiàn)介紹;細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細(xì)胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細(xì)胞說明書部分;細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書;相關(guān)細(xì)胞有：TE671/RD細(xì)胞、UCD-MLA-144細(xì)胞、ZR-75-30細(xì)胞

CHG-5細(xì)胞;細(xì)胞背景資料：少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤；男性;細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細(xì)胞生長特性：貼壁;細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書;相關(guān)細(xì)胞有：SW1573細(xì)胞、A375.S2細(xì)胞、CL 1-5細(xì)胞

BGC-８２３傳代細(xì)胞復(fù)蘇中心；細(xì)胞生長特性：貼壁生長；細(xì)胞形態(tài)特性：上皮樣；細(xì)胞傳代方法：１：３傳代，２-３天換液一次

BGC-８２３傳代細(xì)胞復(fù)蘇平臺；細(xì)胞生長特性：貼壁生長；細(xì)胞形態(tài)特性：上皮樣；細(xì)胞傳代方法：１：３傳代，２-３天換液一次

ML-２傳代細(xì)胞實驗中心；細(xì)胞生長特性：懸??；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書；細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

Z１３８復(fù)蘇細(xì)胞；細(xì)胞生長特性：懸??；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書；細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

MOPC凍存細(xì)胞；細(xì)胞生長特性：半貼壁；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書；細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

Lncap細(xì)胞實驗室；細(xì)胞生長特性：貼壁生長；細(xì)胞形態(tài)特性：上皮樣；梭形；細(xì)胞傳代方法：１：２傳代

LTEP-sm細(xì)胞實驗中心；細(xì)胞生長特性：貼壁；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見細(xì)胞說明書；細(xì)胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

NCI-H４４６細(xì)胞實驗平臺；細(xì)胞生長特性：貼壁/懸浮生長，混合；細(xì)胞形態(tài)特性：上皮樣；細(xì)胞傳代方法：１：２傳代

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