人A組鏈球菌菌壁多糖抗體(ASP)ELISA試劑盒操作步驟相關實驗研究：

風濕性心臟病急性期應用鏈球菌菌壁多糖抗體的診斷價值
摘要：探討應用A組鏈球菌菌壁多糖抗體(ASP)對慢性風濕性心臟病患者風濕活動的判斷價值。方法入選2008年6月至2012年5月間住院的92例慢性風濕性心臟病患者,入院時進行血沉(ESR)、C反應蛋白(CRP)、抗鏈球菌溶血素O(ASO)常規(guī)檢測,以及心電圖、超聲心動圖等檢查,應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定入院時患者血清ASP,根據臨床綜合判斷風濕性心臟病患者有無風濕活動,計算并比較ASP及ASO/ESR/CRP串聯(lián)試驗對風濕活動的判斷價值。結果對于風濕性心臟病風濕活動的診斷:(1)ASO/ESR/CRP串聯(lián)試驗對診斷的敏感性68.0%,特異性50.0%,假陽性率50.0%,假陰性率32.0%,陽性預測值61.8%,陰性預測值56.8%,準確度59.8%,陽性似然比1.36。(2)ASP對診斷的敏感性83.3%,特異性73.7%,陽性預測值81.8%,陰性預測值75.7%,準確度79.3%,陽性似然比3.17;經Kappa檢驗,ASP檢測與臨床診斷的*性,K=0.572,SE=0.087,P<0.01。(3)ASP檢測的敏感性與特異性均高于ASO/ESR/CRP串聯(lián)試驗。
試劑盒的組成： 
（1）結合物及標本的稀釋液；
（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（3）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
（4）酶的底物；
（5）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），elisa試劑盒參考標準品和控制血清（定量測定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實驗試劑，不得用于臨床診斷。
檢測種屬：人、大小鼠、兔、羊、猴、豬、豚鼠ELISA檢測試劑盒等種屬。
標本：血清、血漿、細胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。 
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人A組鏈球菌菌壁多糖抗體(ASP)ELISA試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類標本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中如有沉淀，請再次離心。
血漿：
應根據標本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
尿液：
用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
細胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，當細胞濃度達到100萬/ml左右，通過反復凍融，使細胞破壞并釋放細胞內的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
組織標本：
切割標本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，標本融化后仍保?-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，分裝后留一份待檢測，其余冷凍備用。

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ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。抗體和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和。抗體和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。