Hep3B-GFP人肝癌綠色標記細胞 培養(yǎng)步驟

細胞名稱  Hep3B-GFP人肝癌綠色標記細胞 
組織  人肝癌細胞系
母細胞來源  ATCC
轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染Hygromycin篩選 

質(zhì)粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養(yǎng)基225轉搖菌1h，將轉化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉搖菌6.5h。

6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉染Mluc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉染采用脂質(zhì)體法轉染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時后換培養(yǎng)液。

8.報告基因檢測：Passive Lysis Agent裂解細胞，加入熒光素酶作用底物，將轉染質(zhì)粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。

9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。

慢病毒包裝部分

1. 質(zhì)粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉染時，細胞在培養(yǎng)盤中密度達到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Mluc質(zhì)粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。

2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。

Hep3B-GFP人肝癌綠色標記細胞 培養(yǎng)步驟

慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化hep3B細胞并計數(shù)，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度），37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。

5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。

維持培養(yǎng)。

7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。

8. hep3B-Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質(zhì)粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。

培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
細胞傳代所需時間：3天/代 
篩選標記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
體外和體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)：
hep3B-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：
細胞裂解液的發(fā)光值，數(shù)據(jù)—化學發(fā)光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。
活體成像：1×106皮下2周成瘤
對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
 
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
 
PS：若客戶收到2ml小管細胞，收到細胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內(nèi)，嚴格無菌操作；將小管細胞轉移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。
 
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