Huh-7-LUC人肝癌熒光素酶標記細胞 培養(yǎng)步驟

1.慢病毒包裝部分

1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時，細胞在培養(yǎng)盤中密度達到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。

2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數(shù)，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。
3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。
維持培養(yǎng)。
7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。
8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。
 
?培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
?細胞傳代所需時間：1天/代 
?篩選標記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
?體外實驗數(shù)據(jù)：
1.Huh-7-LUC人肝癌熒光素酶標記細胞 熒光顯微鏡照片(100×)：
2.細胞裂解液的發(fā)光值，數(shù)據(jù)—化學(xué)發(fā)光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。
保證運輸中細胞的正常生長，關(guān)于其價格、報價、貨期，請咨詢我們。

特點：細胞代數(shù)為2-3代左右。

細胞用途：提供用于科研的穩(wěn)定細胞系。

細胞純度：92％

細胞活力：88％（Viability by Trypan Blue Exclusion）。

培養(yǎng)基： 90%高糖DMEM+10%FBS

存儲條件： 50%高糖DMEM+40%FBS+10%DMSO 液氮

細胞檢測：細胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。

儲存方法：液氮（凍存）或復(fù)蘇培養(yǎng)。

規(guī)格：500000cells/瓶

Huh-7/Luc人肝癌細胞背景：大多數(shù)細胞是上皮細胞樣的，也可以見到巨大細胞團和病態(tài)有絲分裂；電鏡下可見細胞表面和橋粒上有微絲。第3天的有絲分裂指數(shù)是59%。移植到同源動物中可以成活。

Huh-7-LUC人肝癌熒光素酶標記細胞 培養(yǎng)步驟

購買細胞注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題貼壁細胞會有少量從瓶壁脫落，將細胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)過夜，隔天再取出觀察。此時多數(shù)細胞均會貼壁，若細胞仍不能貼壁請用臺盼藍染色測定細胞活力，如果證實細胞活力正常，請將細胞離心后用新鮮培養(yǎng)基再次貼壁培養(yǎng)；如果染色結(jié)果顯示細胞無活力，請拍下照片及時和我們聯(lián)系，信息確認后我們?yōu)槟倜赓M寄送一次。

Huh-7/Luc人肝癌細胞培養(yǎng)物的生理環(huán)境不同時定義為其物理化學(xué)環(huán)境中，更好地理解血清的組件，所必需的增殖的生長因子的鑒定，并更好地理解細胞在培養(yǎng)的微環(huán)境（即細胞 - 細胞相互作用，氣體的擴散，與基質(zhì)相互作用）現(xiàn)在允許在無血清培養(yǎng)基中某些細胞系的培養(yǎng)。