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冠狀病毒的幾個離心分離方案

來源:長沙湘智離心機儀器有限公司   2011年07月11日 08:28  

方案一  連續(xù)蔗糖梯度:離心機,轉頭。
單管配置:
1)13PET管:20%-50%(W/W)連續(xù)蔗糖梯度。
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度:用20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%(W/W)蔗糖液各1.5ml,從離心管低部逐層向上鋪設(底部高密度),鋪二管,直立在試管架上室溫過夜,第二天早晨放入冰箱僅5℃預冷2小時。在蔗糖液上部加樣品(約2ml)至距管口3mm。對稱放入P40ST轉頭吊桶(轉頭及吊桶在冰柜中預冷過夜)對稱雙管,38,000rpm(256,000Xg)X 1小時,5℃ 加速8,減速7。
2)13PA管:20%-50%(W/W)連續(xù)蔗糖梯度
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度:用20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%(W/W)蔗糖液各1.2ml,從離心管低部逐層向上鋪設(低部高密度),鋪二管,直立在試管架上室溫過夜,第二天早晨放入冰箱5℃預冷2小時。在蔗糖液上部加樣品(約2ml)至距管口3mm。對稱放入P40ST轉頭吊桶(轉頭及吊桶在冰柜中預冷過夜)對稱雙管,38,000rpm(256,000Xg)X 1小時,5℃ 加速8,減速7。
結果:冠狀病毒應沉降在蔗糖36%-40%之間(注意:空吊桶必須都按編號掛在轉頭上)

方案二 蔗糖階梯梯度
單管配置:用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度,離心管下部為45%(W/W)(PET管為4ml,PA管為3ml),上部為32%(W/W)(PET管為4ml,PA管為3ml),表面加樣品至距管口3mm(約為4.5ml)。對稱雙管,38,000rpm(256,000Xg)X 1小時,5℃ 加速8,減速7。
結果:病毒沉降在二個蔗糖梯度之間。

方案三  Percoll自形成梯度:轉子(6X40ml)
單管配置:Percoll原液6.5ml,0.25M蔗糖23ml加樣品6ml,充分混合后注入40PA離心管至距管口3mm冰箱中預冷2小時后制備二管放入吊桶掛在轉頭上(其余4個空吊桶也要掛上),20,000rpm,1小時,5℃ 加速8,減速8。
結果:病毒沉降在Percoll 1.06密度處。
梯度取出:1)手工取出:離心管傾斜小角度后用定量吸管吸出,13ml離心管分別收集26管(每管0.5ml),PA管分別收集21管(每管0.5ml),各管分別測OD給出OD→離心管管容量曲線,可以看到病毒峰,確定離心管編號后即可移出,蔗糖可通過透析除去.2)儀器收集:用日立 DGF-U梯度形成一收集儀,每次做一個管子,DGF-U后出口接流動池的分光光度計,連續(xù)測OD并繪出曲線后分部收集,根據(jù)病毒峰的位置,可以確定病毒集中在哪些離心管中,透析后得到較純病毒液.

方案四 用凍融法制備的Nycodenz分離冠狀病毒
單管配置 25% Nycondenz(密度1.127g/ml)8ml注入離心管,在-20℃冰箱中凍結,全部凍結后室溫中溶化即成為(從液面到管底)密度從1.08g/ml到1.30g/ml的連續(xù)梯度,從1.08-1.16g/ml為凸指數(shù)曲線,從1.16-1.30g/ml為凹指數(shù)曲線。
     在已溶化的連續(xù)梯度上加入樣品至距管口3mm(PA管約為2.5ml,PET管約為4ml)
日立P40ST轉頭,6x13mlTi吊桶,40,000rpm(284,000xg)12小時,加速8,減速7,20℃
離心后用DGF-U自動收集或人工收集成30管(每管0.3ml左右)在Nycodenz密度1.18g/ml處有病毒峰(離心管中段)。將30管分別測OD并繪制OD→管數(shù)曲線可找到病毒所在管。
對稱管可用30%(W/W)蔗糖配置(密度在20℃時,1.127g/ml)

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