KB-LUC人口腔上皮癌熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)步驟 含STR鑒定

細(xì)胞英文(簡(jiǎn)稱）：KB

細(xì)胞名稱：KB人口腔上皮癌細(xì)胞【已通過STR鑒定】

背景資料

初認(rèn)為這個(gè)細(xì)胞源自口腔表皮癌，但隨后通過同工酶分析、HeLa標(biāo)記染色體和DNA指紋分析發(fā)現(xiàn)，起源細(xì)胞已被HeLa污染。角蛋白陽性。有報(bào)告稱，KB細(xì)胞含有人乳頭狀瘤病毒18 (HPV-18)序列。 

細(xì)胞來源：ATCC CCL-17

代次：P3

規(guī)格：T25

細(xì)胞數(shù)：1x10^6 cells

組織來源：口腔上皮

KB人口腔上皮癌細(xì)胞【已通過STR鑒定】形態(tài)：貼壁；上皮細(xì)胞樣

細(xì)胞活力：95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）

細(xì)胞檢測(cè)：細(xì)胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌

培養(yǎng)條件：RPMI-1640 +10% FBS；37℃，5% CO2

傳代方法：*建議1:2-1:3 兩天換液一次

凍存條件：90%FBS+10%DMSO

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),大致的步驟是這樣:

1.從動(dòng)物胚胎或者一些剛出生的動(dòng)物的器官或者組織上取得細(xì)胞,配制成細(xì)胞懸浮液.把細(xì)胞液放到培養(yǎng)瓶中,在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)--------原代培養(yǎng).

但是,不要以為這樣就能一直無限培養(yǎng)下去.

因?yàn)镵B人口腔上皮癌細(xì)胞【已通過STR鑒定】在那個(gè)瓶壁上生長(zhǎng)的時(shí)候,如果大量增殖,細(xì)胞之間會(huì)彼此相碰,細(xì)胞細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖,出現(xiàn)一種接觸抑制.

2.我們?yōu)榱怂鼈兡芾^續(xù)增殖,就用胰蛋白酶再把它們分開,然后再配制成細(xì)胞懸浮液,分開裝到好幾個(gè)瓶子里繼續(xù)培養(yǎng)--------傳代培養(yǎng).

細(xì)胞株&細(xì)胞系

1.它們都是傳代培養(yǎng)里面的概念.都是10代以后的

2.細(xì)胞株是傳代培養(yǎng)里10~50（不同物種不同組織細(xì)胞有差別吧）代,細(xì)胞系是50代以后的;

3.對(duì)于細(xì)胞繁殖而言,傳到10代就很不容易了,所以細(xì)胞株是極少數(shù)的細(xì)胞

4.50代以后,細(xì)胞繁殖會(huì)出現(xiàn)另一個(gè)危機(jī),基本上沒有什么細(xì)胞能再傳下去了.但是,有細(xì)胞發(fā)生了基因突變,像一個(gè)癌細(xì)胞一樣無限地分裂下去,這就是細(xì)胞系.

KB-LUC人口腔上皮癌熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)步驟 含STR鑒定
1.慢病毒包裝部分
1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。
2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細(xì)胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細(xì)胞中。
3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
維持培養(yǎng)。
7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。
8. 4T1-Gluc/Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。GFP和mCherry表達(dá)通過熒光顯微鏡觀察。