摘要：本文介紹了采用配置 APCI 源的 Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，同時(shí)檢測(cè)沙坦 藥物中六種亞硝胺類基因毒性雜質(zhì) NDMA、NDEA、NMBA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA 的 方法。該方法涵蓋了歐美藥檢系統(tǒng)截止到 2019 年 11 月提到的全部亞硝胺類基因毒性雜 質(zhì)，操作簡(jiǎn)單、特異性高，且靈敏度滿足目前*，適用于沙坦類原料藥和部分制劑 中 6 種亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的快速篩查和準(zhǔn)確定量。

前言：2018 年 7 月，纈沙坦原料藥被曝出含有亞硝胺類基因毒性雜質(zhì) N-亞硝基二jia胺 (NDMA)， 9 月份，該類藥物又曝出含有另一種亞硝胺類雜質(zhì) N-亞硝基二乙胺 (NDEA)。2019 年 3 月，第三種亞硝胺類雜質(zhì) N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸 (NMBA) 在氯沙坦鉀中檢出超標(biāo)[1]。 沙坦類降壓藥的全名是“血管緊張素受體阻斷劑”(ARB)。由于此類藥物都帶有“沙坦” 二字，因此俗稱“沙坦類降壓藥”，是目前治療高血壓的一線降壓藥，使用廣泛。亞硝胺 (Nitrosamine) 是一類通式為 R1 N(–R2 )–N=O 的胺化合物，結(jié)構(gòu)如圖 1 所示，其大部分成 員都屬于強(qiáng)致癌物。根據(jù)世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單，從沙坦類降 壓藥中發(fā)現(xiàn)的 NDEA、NDMA 屬于 2A 類致癌物，即“對(duì)人很可能致癌，此類致癌物對(duì)人 致癌性證據(jù)有限，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌性證據(jù)充分”[2]。另外，根據(jù) FDA 的初步評(píng)估，NMBA 暴露風(fēng)險(xiǎn)與 NDMA 相同[1]。

目前，關(guān)于沙坦類藥物中亞硝胺的檢測(cè)，可以在上查到歐洲 OMCL 實(shí)驗(yàn)室和 FDA 公布的 GC/MS、LC 和 LC/MS 方法。其中， FDA 在 2019 年 8 月公布了 LC-HRMS 方法和 RapidFire-MS/MS 方法[3, 4]，對(duì)沙坦類藥物中可能含有的 6 種亞硝胺類基因毒性雜 質(zhì)進(jìn)行篩查和半定量分析。FDA 提出，除先前檢出的 NDEA、 NDMA 和 NMBA 以外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和工藝研究，還有三種亞 硝胺類雜質(zhì)可能存在于 ARB 藥物中，分別是 N-亞硝基乙基異丙 基胺 (N-nitrosoethylisopropylamine, NEIPA)、N-亞硝基二異丙 基胺 (N-nitrosodiisopropylamine, NDIPA) 和 N-亞硝基二丁基胺 (N-nitrosodibutylamine, NDBA)。鑒于 LC-HRMS 和 RapidFire-MS/MS 配置比較特殊，且無(wú)法用于準(zhǔn)確定量分析，我們參考 FDA 方法， 開發(fā)出采用常規(guī) LC-APCI-QQQ 配置同時(shí)檢測(cè)沙坦藥物中 6 種亞硝 胺類基因毒性雜質(zhì)的方法。所開發(fā)的方法操作簡(jiǎn)單、特異性高， 且靈敏度滿足目前*。

實(shí)驗(yàn)部分：試劑和樣品 甲醇為質(zhì)譜級(jí)，甲酸為色譜級(jí)，購(gòu)于 Merck；所用實(shí)驗(yàn)用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水；6 種亞硝胺 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品由合作用戶提供。

儀器和設(shè)備：采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色譜系統(tǒng)與 6470三重四 極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)配備如下：二元泵（部件號(hào) G7120A）、自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G7167B）、柱溫箱（部色譜柱選用 Agilent InfinityLab Poroshell PFP（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件號(hào) 695775-408）。如果沙坦類樣品色譜保留較強(qiáng) （如纈沙坦和厄貝沙坦），也可以用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件號(hào) 695775-902）進(jìn)行 分離。件號(hào) G7116B）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱取 6 種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇超聲溶解，并定量稀釋制成 每 1 mL 中約含 10 mg 目標(biāo)化合物的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用水逐 級(jí)稀釋成每 1 mL 中分別包含約 0.1、0.5、1、5、10、50、100、 500、1000 ng 目標(biāo)化合物的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品線性系列溶液。線 性范圍和相關(guān)濃度點(diǎn)可根據(jù)檢測(cè)需要自行調(diào)整。

樣品前處理：將 100 mg 沙坦類樣品研磨后，溶于 10 mL 水中，用超聲提取 10 分鐘，過濾后分析。 對(duì)于水溶性欠佳的沙坦樣品，先用大約 2 mL 甲醇溶解后，經(jīng)超聲 提取后，用水稀釋到 10 mL，再次超聲提取 10 分鐘，濾除沉淀后 進(jìn)行分析。終濃度以 API 計(jì)為 10 mg/mL。

結(jié)果與討論：色譜分離結(jié)果 本文參考 FDA 方法，基于窄內(nèi)徑 Poroshell 系列色譜柱低柱壓、 高柱效的優(yōu)勢(shì)，適當(dāng)降低了流速，縮短了梯度時(shí)間和平衡時(shí)間。 不同沙坦類藥物在反相色譜體系中保留能力不同。因此，本文分 別對(duì)纈沙坦和厄貝沙坦進(jìn)行了測(cè)試，兩者在常規(guī) C18 色譜柱上可 以分離。而氯沙坦鉀保留相對(duì)較弱，需要采用 PFP 色譜柱以改善 API 的保留特性，確保分子量較大的 NDBA 獲得理想的回收率。 洗脫梯度起始采用高比例水相，需要注意復(fù)溶樣品的有機(jī)相不宜 過高，否則會(huì)影響分子量較小的 NDMA 的峰形和靈敏度。梯度后 半段采用高比例有機(jī)相洗脫沙坦類 API。由于 API 濃度很高，為 避免污染質(zhì)譜系統(tǒng)，建議此時(shí)將流路設(shè)置為“引入廢液”。 在本文中所用的色譜條件下，6 種亞硝胺之間及雜質(zhì)與 API 之間 分離度良好，典型的 TIC 色譜圖如圖 2 所示。因?yàn)槭芟拗频?N-N 鍵存在順反結(jié)構(gòu) (syn and anti conformers)[5]，NMBA 和 NEIPA 在 色譜體系中表現(xiàn)為雙峰，在定量分析時(shí)，需要對(duì)兩個(gè)峰積分并合 并峰面積[1]。 ×104 +TTC MRM (** -> **

結(jié)論： 根據(jù) FDA 的報(bào)告，沙坦類藥物中含有或可能含有 6 種亞硝胺類 基因毒性雜質(zhì)，即 NDMA、NDEA、NMBA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA。本文采用配備 APCI 源的 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系 統(tǒng)，同時(shí)檢測(cè)上述 6 種亞硝胺類化合物，方法簡(jiǎn)單、特異性高、 重現(xiàn)性好，靈敏度滿足目前 FDA 規(guī)定的*。實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了 不同的沙坦基質(zhì)，采用適合的色譜柱和色譜方法，可以很好地滿 足靈敏度和回收率要求。另外，通過將方法設(shè)置為將高濃度藥品 基質(zhì)引入廢液而不引入離子源，可減少對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)的污染。該方 法適用于對(duì)沙坦類原料藥和部分制劑中的 6 種亞硝胺類基因毒性 雜質(zhì)進(jìn)行快速篩查和準(zhǔn)確的定量分析。