■ 什么是 FFPE？

FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin Embedded），即福爾馬林固定石蠟包埋樣本。由于這種處理方法能夠較長(zhǎng)時(shí)間地保存組織或制備檢驗(yàn)所需的組織標(biāo)本，所以在臨床病理檢驗(yàn)、腫瘤基因檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。在世界范圍內(nèi)，大約有數(shù)十億份組織樣品保存在醫(yī)院或者組織樣品庫中，其中絕大多數(shù)是使用福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理的樣品。

FFPE 樣本通常代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料，為闡明疾病機(jī)制、回顧性研究等提供了寶貴的資源，但是由于樣本制備以及儲(chǔ)存等多方面的原因，F(xiàn)FPE 樣本中的 DNA 質(zhì)量往往很差。所以如何通過 FFPE 樣本中獲得的 DNA 建立合格的文庫已成為當(dāng)前測(cè)序研究領(lǐng)域亟待解決的問題。
 

圖1 FFPE 樣本

■ 為何 FFPE 樣本中的核酸質(zhì)量差？

FFPE 樣本特殊的制作方法和保存過程都會(huì)對(duì)核酸分子造成多方面的影響。組織醫(yī)學(xué)樣本在離體后即開始發(fā)生降解，福爾馬林的固定使組織中的核酸與核酸或核酸與蛋白之間交聯(lián)，石蠟的滲入過程進(jìn)一步加速核酸的降解，保存時(shí)間及環(huán)境對(duì)樣品中的核酸也有極大的影響。所以 FFPE 樣本中的核酸質(zhì)量往往質(zhì)量很差， 進(jìn)而影響文庫構(gòu)建的產(chǎn)量以及均一性，導(dǎo)致建庫失敗。

表1 影響 FFPE 樣本中 DNA 質(zhì)量的主要因素

■ 如何提高 FFPE 樣本的建庫質(zhì)量？

1. 樣本質(zhì)量控制

對(duì)于高質(zhì)量的 DNA 樣本，通過吸光度檢測(cè)樣品純度（Nanodrop）和熒光定量（Qubit）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)即可，但是這對(duì)于 FFPE 樣本來源的 DNA 是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的， 需要進(jìn)一步的質(zhì)控評(píng)估。目前主要的方法有以下兩種：

1）通過對(duì)廣泛存在于 gDNA 的 Alu 序列（Alu 247 與 Alu 115）的擴(kuò)增產(chǎn)物或者不同 qPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物濃度的比值來衡量 DNA 的完整性；

注：Alu247/Alu115：Alu 序列是廣泛分布于人基因組的約 300 bp 短重復(fù)序列。通過長(zhǎng)（247 bp; Alu 247）、短（115 bp; Alu115）擴(kuò)增子比值可評(píng)估 gDNA 的完整度。

Q Score：即 Quality Score，是指不同 qPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物濃度的比值。常用的 Q129/Q41 和 Q305/Q41 比值分別指 129 bp 和 41 bp 產(chǎn)物、305 bp 和 41 bp 產(chǎn)物濃度比值。

2) DIN：即 DNA Integrity Number，是指 DNA 經(jīng)安捷倫生物分析系統(tǒng) 2200/4200 TapeStation 分析并計(jì)算的出的數(shù)值，是對(duì) DNA 完整性的評(píng)分。

表 2 FFPE 樣本質(zhì)控參數(shù)

2. 樣本損傷修復(fù)

FFPE 樣本由于制作與儲(chǔ)存等多方面的原因?qū)е聵颖举|(zhì)量不佳，如果質(zhì)控之后樣本質(zhì)量很差，可對(duì)樣本 DNA 進(jìn)行修復(fù)。通常修復(fù)液由不同的酶類根據(jù)不同比例混合而成，能夠?qū)?DNA 樣本中胞嘧啶脫氨成尿嘧啶、切刻或者缺口等問題能夠進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而從整體上提升建庫成功率。
 

表3 FFPE 修復(fù)試劑作用

通常情況下，F(xiàn)FPE 修復(fù)試劑可以通過對(duì)樣本的修復(fù)顯著提高低質(zhì)量 FFPE樣本的建庫產(chǎn)出，而對(duì)高質(zhì)量 FFPE樣本的建庫產(chǎn)量提升并不明顯（如下圖所示）。

圖 2 FFPE 修復(fù)試劑盒對(duì)建庫產(chǎn)量的影響（Input DNA: 10 ng; Cycles：10）
數(shù)據(jù)來源于翊圣 UltimaTM DNA 建庫試劑盒（Cat12199）測(cè)試結(jié)果，F(xiàn)FPE 修復(fù)試劑為翊圣 FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606)

3. 樣本高效建庫

高效的建庫試劑盒能夠zui大程度的利用有限的樣本，使其轉(zhuǎn)化為合格的文庫。FFPE樣本由于樣本濃度更低，質(zhì)量較差，往往對(duì)試劑盒的要求也更高，搭配更高效的建庫試劑盒也成為了 FFPE樣本建庫的*之選。

建庫試劑盒的效率評(píng)估指標(biāo)主要 3 個(gè)方面：

NGS 建庫文庫轉(zhuǎn)化率：指文庫中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數(shù)的比值。文庫轉(zhuǎn)化率影響文庫的多樣性與文庫的質(zhì)量，高的文庫轉(zhuǎn)化率一定程度上意味著文庫豐度與測(cè)序的覆蓋度更好，尤其是在 FFPE樣本中可能出現(xiàn)一些其他類型損傷的情況下，轉(zhuǎn)化率過低勢(shì)必會(huì)影響終文庫的產(chǎn)出與文庫的豐度。

圖 3 雙端連接的文庫通過橋式擴(kuò)增成簇

文庫擴(kuò)增均一性：指的是讀取數(shù)據(jù)在基因組或目標(biāo)區(qū)域的分布均一程度。其生信分析圖如圖 4 所示，一般認(rèn)為覆蓋越均勻，達(dá)到特定深度所需的測(cè)序數(shù)據(jù)就越少，覆蓋均一性的偏向通常是在 DNA pian段化和文庫擴(kuò)增步驟中引入的。

圖 4 不同 GC 含量樣本測(cè)序數(shù)據(jù)均一性

文庫擴(kuò)增效率與保真性：文庫擴(kuò)增效率即獲得特定文庫產(chǎn)量所需的循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)越低意味著擴(kuò)增效率越高；保真性即 PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)堿基錯(cuò)配的數(shù)量，相同循環(huán)數(shù)條件下，錯(cuò)配數(shù)量少則保真性越高。


■ 十年匠心品質(zhì)，只為一顆初心——Ultima™，就是你要的終ji檔案

Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit（Cat#12199）是翊圣生物針對(duì) Illumina 測(cè)序平臺(tái)研發(fā)的高效 DNA 建庫試劑盒，本品采用高質(zhì)量酶學(xué)組成，具有優(yōu)異的文庫轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率，*解決 FFPE/cfDNA 建庫難的問題。多樣本驗(yàn)證，同等條件下文庫產(chǎn)量是 K*品牌的 1-3 倍。適用于常規(guī)動(dòng)植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA 等所有樣本建庫，助力獲得優(yōu)異的測(cè)序數(shù)據(jù)。

精簡(jiǎn)流程：末端修復(fù)與 A 尾巴添加一步完成，無需純化，大大縮減建庫時(shí)間；
*效的 DNA 連接酶：自主創(chuàng)新研發(fā)高效 DNA 連接酶 Fast T4 DNA Ligase，多樣本驗(yàn)證連接效率是 N*品牌的 2～3 倍；
強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶：自主創(chuàng)新研發(fā)強(qiáng)擴(kuò)增效率高保真酶 Canace^® Ⅱ，極大降低文庫擴(kuò)增帶來的偏好性。性能媲美 K*品牌 H*Fi 酶；

圖 5 UltimaTM 建庫試劑盒多樣本驗(yàn)證均可獲得優(yōu)異的文庫質(zhì)量