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上海琛藝實(shí)業(yè)有限公司提供ATCC原代細(xì)胞，ATCC菌株代購(gòu)，同時(shí)上海琛藝新增細(xì)胞庫(kù)，具有自己的研發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)庫(kù)，上千株細(xì)胞具有STR鑒定，開春大放送，*，同時(shí)還有好禮相送，具體歡迎咨詢我們銷售人員。。。。

PC12-GFP大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤綠色標(biāo)記細(xì)胞 處理方法

【細(xì)胞傳代】：1:3 傳代

【細(xì)胞活力】：90％（Viability by Trypan Blue Exclusion）

【細(xì)胞檢測(cè)】：細(xì)胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌

【細(xì)胞凍存】：液氮凍存（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%DMSO+20%FBS）

【細(xì)胞運(yùn)輸】：干冰運(yùn)輸（1 Vial）或活細(xì)胞運(yùn)輸（T-25 flasks）

詳細(xì)背景： 這株細(xì)胞的細(xì)胞骨架染色突出呈現(xiàn)肌動(dòng)蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中有豐富的平行微絲。有報(bào)道稱在1uM血管緊張素II存在下，它們會(huì)收縮。細(xì)胞在軟瓊脂中形成克隆，SV40大T抗原陽(yáng)性。

細(xì)胞來(lái)源： 細(xì)胞主要來(lái)源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數(shù)國(guó)內(nèi)外著名大學(xué)建系

PC12-GFP大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤綠色標(biāo)記細(xì)胞 處理方法

· 母細(xì)胞來(lái)源  客戶

· 轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選 

1. 質(zhì)粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴(kuò)增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無(wú)抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個(gè)單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。

6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達(dá)鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡(jiǎn)稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡(jiǎn)稱Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時(shí)后換培養(yǎng)液。

8.報(bào)告基因檢測(cè)：Passive Lysis Agent裂解細(xì)胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。

9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測(cè)正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。

培養(yǎng)步驟：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL*培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1、對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞，收到細(xì)胞后，用75%酒精噴灑整個(gè)管子消毒后放到超凈臺(tái)或安全柜內(nèi)，嚴(yán)格無(wú)菌操作；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進(jìn)行傳代（方法同上）。

2、對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞，收到細(xì)胞后，用75%酒精噴灑整個(gè)管子消毒后放到超凈臺(tái)或安全柜內(nèi)，嚴(yán)格無(wú)菌操作；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進(jìn)行傳代（方法同上）。

上海琛藝實(shí)業(yè)是一家專業(yè)從事細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)產(chǎn)品的公司，擁有獨(dú)立細(xì)胞房（可隨時(shí)約定參觀），供應(yīng)胎牛血清，無(wú)血清細(xì)胞凍存液，無(wú)血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)基，胰酶，雙抗，*培養(yǎng)基，STR鑒定細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞等，專業(yè)，專注，性價(jià)比高，是您Shou選之家。

NCI-H460-LUC 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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NCI-N87[N87]-LUC 人胃癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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NUTU-19-LUC 大鼠卵巢癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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OVCaR-3-LUC 人卵巢癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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PANC-1-LUC 人胰腺癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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PC12-LUC 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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PC-3-LUC 人前列腺癌-熒光素酶標(biāo)記

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Raji-LUC 人Burkitt`s淋巴瘤細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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RKO-LUC 人結(jié)腸癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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RL95-2-LUC 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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S-180-LUC 小鼠肛門肉瘤細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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Saos-2-LUC 人成骨肉瘤細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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SGC-7901-LUC 人胃癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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TE-10-LUC 人食管癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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TE-11-LUC 人食管癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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TE-13-LUC 人食管癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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U-2OS-LUC 人骨肉瘤細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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U251-LUC 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記

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U87MG-LUC 人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

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