分光光度法 50 管/48 樣

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機(jī)磷化合物礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷

的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。土壤磷酸酶受到

土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH 顯著影響。通常按照其適 pH 范圍，分為堿性、中性

和酸性三種類型磷酸酶。

測(cè)定原理：

堿性環(huán)境中，S-AKP/ALP 催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過測(cè)定酚的生成

量即可計(jì)算出 S-AKP/ALP 活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比

色皿、冰、蒸餾水、無水乙醇和甲苯。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。用前加 50mL 蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 1152μL 無水乙醇（自備），48 μL 蒸餾水充分

溶解。（變褐色后不能再使用）

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 瓶，0.5μmol/mL 苯酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

催化反應(yīng)：

稱取風(fēng)干混勻土壤約 0.1g，加入 50μL 甲苯（自備），輕搖 15min；加 400μL 試劑一并且搖

勻后，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱，開始計(jì)時(shí)，催化反應(yīng) 24h；到時(shí)后迅速加入 1mL 試劑二充分

混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。8000g，25℃離心 10min，取上清液置于冰上待測(cè)。

顯色反應(yīng)：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 蒸餾水，100 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分

混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μL，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A

空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)液，100 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分

混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μL，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A

標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 μL 上清液，100 μL 試劑三，20 μL 試劑四，充分

混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μL，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為 A

測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

S-ALP 活性計(jì)算公式：

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放 1μmol 酚為 1 個(gè)酶活單位。

S-AKP/ALP（μmol/d/g 土樣）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V

總÷W÷T

= 0.725×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/mL；V 總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催

化反應(yīng)時(shí)間，24 h=1 d。