TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡常見問題及解決方案
大家好,我是你們的實(shí)驗(yàn)小助手小翊,上一期我們講到了細(xì)胞凋亡檢測(cè)的各種手段。這一期我們介紹其中的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法--TUNEL法,重點(diǎn)分析TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡常見問題及解決方案。首先要先了解一下TUNEL染色步驟,如下圖所示。
圖1 TUNEL染色操作步驟(注:細(xì)胞核染色步驟可選)
用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中,需要用到蛋白酶K、熒光素-dUTP、TdT酶等各種試劑,除此以外,還要設(shè)置陽性和陰性對(duì)照組,面對(duì)試劑盒各組分的作用以及繁瑣的操作步驟,許多人表示疑惑,下面我們就一一解答。
1. TUNEL試劑盒主要成分及功能
1)Equilibration緩沖液:用于維持一定的反應(yīng)條件,緩沖液中的Mg2+降低背景,Mn2+增強(qiáng)染色效果。
2)蛋白酶K(Proteinase K):通透細(xì)胞膜和核膜,保證TUNEL探針進(jìn)入細(xì)胞中,保證染色充分。
3)熒光素-dUTP:標(biāo)記3'-OH末端和作為TdT酶的底物。
4)TdT酶:催化dUTP標(biāo)記3'-OH末端的關(guān)鍵酶。
2 .陽性組、陰性組、實(shí)驗(yàn)組
1)陽性組:用DNase酶處理,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、暴露出3,-OH末端。每次實(shí)驗(yàn)做一個(gè)即可。
2)陰性組:不加TdT酶,其余操作和實(shí)驗(yàn)組相同。每種切片樣本各需要做一個(gè)陰性對(duì)照。比如有5個(gè)老鼠的肺組織切片樣本,那么就需要做5個(gè)陰性組。
3)實(shí)驗(yàn)組:除了陽性組和陰性組,所有的樣本均是實(shí)驗(yàn)組。
3.為什么設(shè)置陽性組、陰性組
1)陽性組:用來驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無問題。
2)陰性組:a.排除細(xì)胞自身凋亡以及操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?/span>;b.調(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度。
除此以外,大家或多或少會(huì)遇到染色結(jié)果異常,包括熒光信號(hào)弱、沒有熒光信號(hào)、假陽性高、熒光背景強(qiáng)等問題。染色失敗的原因主要包括樣本處理不當(dāng)、染色不充分、曝光時(shí)間過長等,可從以下幾個(gè)方面對(duì)癥分析。
4. 熒光信號(hào)弱或沒有熒光信號(hào)
若已知細(xì)胞或者組織樣本處于細(xì)胞凋亡狀態(tài),但是用TUNEL試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)偏弱或沒有信號(hào)。
4.1樣本處理不當(dāng)
1)樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點(diǎn),便于染色。
2)脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 ºC 20 min,再使用二甲苯兩次5-10 min;而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。
3)Proteinase K的孵育時(shí)間過短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時(shí)間,常用時(shí)間10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min,30μm左右的片子孵育30 min。
4)Proteinase K濃度過低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL。
5)放置在-20 ºC保存較長時(shí)間的切片不新鮮,減低染色效率。建議使用新鮮切片。
4.2染色操作不當(dāng)
6)染色時(shí)間過短。建議一般 37 ºC 孵育60 min,可以根據(jù)凋亡損傷程度,可長至2 h,但要結(jié)合背景著色。
7)TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。
8)TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制,短時(shí)間在冰上保存。不宜長期保存,長期保存會(huì)導(dǎo)致TdT酶失活。
9)樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后,請(qǐng)蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進(jìn)行,保證樣本均勻染色,又可防止反應(yīng)液干燥。
4.3熒光檢測(cè)操作不當(dāng)
10)操作未避光。由于熒光易碎滅,建議標(biāo)記與檢測(cè)樣本時(shí),載玻片要避光,觀察時(shí)要盡量快。
5.非特異性染色(假陽性高)
若已知細(xì)胞或者組織樣本依然處于活細(xì)胞狀態(tài),但是用TUNEL試劑盒檢測(cè),出現(xiàn)了非特異性染色,和處理過的熒光信號(hào)一樣強(qiáng),甚至比陽性對(duì)照組熒光信號(hào)還要強(qiáng)。
5.1樣本處理不當(dāng)
1)使用酸性或堿性固定液,導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞。
2)固定液濃度過高,導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議使用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)。
3)固定時(shí)間過長,導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議控制固定時(shí)間在4 ℃放置25 min。
4)蛋白酶K處理時(shí)間過長,破壞核酸結(jié)構(gòu),出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)縮短處理時(shí)間。
5)蛋白酶K濃度過大,破壞核酸結(jié)構(gòu),出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶 K溶液濃度,一般工作液濃度為20 μg/mL。
5.2 染色操作不當(dāng)
6)TUNEL染色時(shí)間過長。建議一般是 37 ºC 孵育60 min,可以根據(jù)凋亡損傷程度,可長至2 h,但要結(jié)合背景著色。
7)未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次,來避免切片的非特異性染色。
6.熒光背景強(qiáng)
6.1染色操作不當(dāng)
1)TUNEL染色時(shí)間過長。建議染色時(shí)間適當(dāng),一般是 37 ºC 孵育60 min,避免串色。
2)TUNEL染色液濃度過大。建議增大稀釋倍數(shù),優(yōu)化濃度。
3) 使用試劑盒提供的二價(jià)陽離子優(yōu)化反應(yīng),試劑盒中的Mg2+可降低背景,Mn2+可增強(qiáng)染色效果。
4)PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次,來避免切片樣本中殘留的染料。
6.2熒光檢測(cè)操作不當(dāng)
5)曝光時(shí)間過長。建議調(diào)整曝光條件,先對(duì)陰性組調(diào)整到無背景光,然后用這個(gè)曝光條件去拍攝實(shí)驗(yàn)組(可以微調(diào),但是不需要大調(diào))。
以上就是小翊為大家整理的TUNEL實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問題及相應(yīng)的建議,希望對(duì)大家有所幫助,同時(shí)也歡迎大家積極留言補(bǔ)充,小翊會(huì)耐心為您解答。
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