TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡常見問題及解決方案

大家好，我是你們的實(shí)驗(yàn)小助手小翊，上一期我們講到了細(xì)胞凋亡檢測(cè)的各種手段。這一期我們介紹其中的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法--TUNEL法，重點(diǎn)分析TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡常見問題及解決方案。首先要先了解一下TUNEL染色步驟，如下圖所示。

圖1 TUNEL染色操作步驟（注：細(xì)胞核染色步驟可選）

用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中，需要用到蛋白酶K、熒光素-dUTP、TdT酶等各種試劑，除此以外，還要設(shè)置陽性和陰性對(duì)照組，面對(duì)試劑盒各組分的作用以及繁瑣的操作步驟，許多人表示疑惑，下面我們就一一解答。

1. TUNEL試劑盒主要成分及功能

1）Equilibration緩沖液：用于維持一定的反應(yīng)條件，緩沖液中的Mg²⁺降低背景，Mn²⁺增強(qiáng)染色效果。

2）蛋白酶K（Proteinase K）：通透細(xì)胞膜和核膜，保證TUNEL探針進(jìn)入細(xì)胞中，保證染色充分。

3）熒光素-dUTP：標(biāo)記3'-OH末端和作為TdT酶的底物。

4）TdT酶：催化dUTP標(biāo)記3'-OH末端的關(guān)鍵酶。

2 .陽性組、陰性組、實(shí)驗(yàn)組

1）陽性組：用DNase酶處理，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、暴露出3^，-OH末端。每次實(shí)驗(yàn)做一個(gè)即可。

2）陰性組：不加TdT酶，其余操作和實(shí)驗(yàn)組相同。每種切片樣本各需要做一個(gè)陰性對(duì)照。比如有5個(gè)老鼠的肺組織切片樣本，那么就需要做5個(gè)陰性組。

3）實(shí)驗(yàn)組：除了陽性組和陰性組，所有的樣本均是實(shí)驗(yàn)組。

3.為什么設(shè)置陽性組、陰性組

1）陽性組：用來驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無問題。

2）陰性組：a.排除細(xì)胞自身凋亡以及操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?/span>；b.調(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度。

除此以外，大家或多或少會(huì)遇到染色結(jié)果異常，包括熒光信號(hào)弱、沒有熒光信號(hào)、假陽性高、熒光背景強(qiáng)等問題。染色失敗的原因主要包括樣本處理不當(dāng)、染色不充分、曝光時(shí)間過長(zhǎng)等，可從以下幾個(gè)方面對(duì)癥分析。

4. 熒光信號(hào)弱或沒有熒光信號(hào)

若已知細(xì)胞或者組織樣本處于細(xì)胞凋亡狀態(tài)，但是用TUNEL試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)偏弱或沒有信號(hào)。

4.1樣本處理不當(dāng)

1）樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點(diǎn)，便于染色。

2）脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 ºC 20 min，再使用二甲苯兩次5-10 min；而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。

3）Proteinase K的孵育時(shí)間過短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時(shí)間，常用時(shí)間10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

4）Proteinase K濃度過低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL。

5）放置在-20 ºC保存較長(zhǎng)時(shí)間的切片不新鮮，減低染色效率。建議使用新鮮切片。

4.2染色操作不當(dāng)

6）染色時(shí)間過短。建議一般 37 ºC 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長(zhǎng)至2 h，但要結(jié)合背景著色。

7）TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。

8）TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)致TdT酶失活。

9）樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進(jìn)行，保證樣本均勻染色，又可防止反應(yīng)液干燥。

4.3熒光檢測(cè)操作不當(dāng)

10）操作未避光。由于熒光易碎滅，建議標(biāo)記與檢測(cè)樣本時(shí)，載玻片要避光，觀察時(shí)要盡量快。

5.非特異性染色（假陽性高）

若已知細(xì)胞或者組織樣本依然處于活細(xì)胞狀態(tài)，但是用TUNEL試劑盒檢測(cè)，出現(xiàn)了非特異性染色，和處理過的熒光信號(hào)一樣強(qiáng)，甚至比陽性對(duì)照組熒光信號(hào)還要強(qiáng)。

5.1樣本處理不當(dāng)

1）使用酸性或堿性固定液，導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞。

2）固定液濃度過高，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

3）固定時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽性。建議控制固定時(shí)間在4 ℃放置25 min。

4）蛋白酶K處理時(shí)間過長(zhǎng)，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)縮短處理時(shí)間。

5）蛋白酶K濃度過大，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶 K溶液濃度，一般工作液濃度為20 μg/mL。

5.2 染色操作不當(dāng)

6）TUNEL染色時(shí)間過長(zhǎng)。建議一般是 37 ºC 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長(zhǎng)至2 h，但要結(jié)合背景著色。

7）未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片的非特異性染色。

6.熒光背景強(qiáng)

6.1染色操作不當(dāng)

1）TUNEL染色時(shí)間過長(zhǎng)。建議染色時(shí)間適當(dāng)，一般是 37 ºC 孵育60 min，避免串色。

2）TUNEL染色液濃度過大。建議增大稀釋倍數(shù)，優(yōu)化濃度。

3) 使用試劑盒提供的二價(jià)陽離子優(yōu)化反應(yīng)，試劑盒中的Mg²⁺可降低背景，Mn²⁺可增強(qiáng)染色效果。

4）PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來避免切片樣本中殘留的染料。

6.2熒光檢測(cè)操作不當(dāng)

5）曝光時(shí)間過長(zhǎng)。建議調(diào)整曝光條件，先對(duì)陰性組調(diào)整到無背景光，然后用這個(gè)曝光條件去拍攝實(shí)驗(yàn)組（可以微調(diào)，但是不需要大調(diào)）。

以上就是小翊為大家整理的TUNEL實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問題及相應(yīng)的建議，希望對(duì)大家有所幫助，同時(shí)也歡迎大家積極留言補(bǔ)充，小翊會(huì)耐心為您解答。

已發(fā)表文章

[1] Qian Y, Wang Y, Jia F, et al. Tumor-microenvironment controlled nanomicelles with AIE property for boosting cancer therapy and apoptosis monitoring[J]. Biomaterials, 2019, 188: 96-106.  (IF 9.85)

[2] Xu T, Ding W, Ao X, et al. ARC regulates programmed necrosis and myocardial ischemia/reperfusion injury through the inhibition of mPTP opening[J]. Redox Biology, 2019, 20: 414-426.  (IF 8.37)

[3] Han Y Q, Ming S L, Wu H T, et al. Myostatin knockout induces apoptosis in human cervical cancer cells via elevated reactive oxygen species generation[J]. Redox Biology, 2018, 19: 412-428.  (IF 8.37)

[4] Liu Q, Qian Y, Li P, et al. 131 I-labeled copper sulfide-loaded microspheres to treat hepatic tumors via hepatic artery embolization[J]. Theranostics, 2018, 8(3): 785.  (IF 8.12 )

精彩回顧

精品推薦 | 有了它們，細(xì)胞凋亡檢測(cè)再也不愁

公司介紹

上海翊圣生物科技有限公司（Yeasen Biotech Co., Ltd.）成立于2009年，是一家專注于酶制劑和抗原抗體開發(fā)的高新技術(shù)型企業(yè)，致力于為生命科學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)的科研客戶及精準(zhǔn)醫(yī)療相關(guān)行業(yè)的工業(yè)客戶提供高質(zhì)量的產(chǎn)品和優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。

翊圣生物現(xiàn)階段建設(shè)有分子、蛋白、細(xì)胞和免疫四大技術(shù)平臺(tái)，擁有全面豐富的產(chǎn)品線，包括PCR、qPCR、高保真DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)制劑和克隆試劑盒等；高通量MaxUP系列DNA/RNA建庫試劑盒、文庫構(gòu)建磁珠和文庫定量等；細(xì)胞培養(yǎng)、支原體檢測(cè)、預(yù)防和去除試劑等；以及體外診斷相關(guān)的酶原料、試劑和磁珠等多種試劑和試劑盒。公司服務(wù)于全國各級(jí)高校、研究所、醫(yī)院、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和生物醫(yī)藥公司等30000+客戶，助力發(fā)表高質(zhì)量SCI論文2000余篇，每年為國家和企業(yè)節(jié)省經(jīng)費(fèi)達(dá)5000萬以上。