MB50007 v.A

  線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  線粒體呼吸鏈復(fù)合物I（NADH－輔酶Q還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q同功類似物和特異性抑制劑，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動物、人體、酵母）以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－輔酶Q還原酶的特異性活性檢測。其用于衰老、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

線粒體呼吸鏈復(fù)合物I，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是線粒體電子傳遞鏈中大的結(jié)構(gòu)成分：含有30至40多個多肽結(jié)構(gòu)。其特征性的酶活性是魚藤酮敏感的NADH－輔酶Q還原酶（NADH:Q Reductase）。復(fù)合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，為整個呼吸鏈反應(yīng)系統(tǒng)的*步。基于輔酶Q底物，在魚藤酮存在與否的情況下，通過NADH－輔酶Q還原酶的催化，轉(zhuǎn)化成還原型泛醌（CoQH2），同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度儀下產(chǎn)生吸收峰值的變化（340nm 波長），由此定量測定NADH－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：

產(chǎn)品內(nèi)容

  緩沖液（Reagent A）  毫升

  反應(yīng)液（Reagent B）  毫升

  陰性液（Reagent C）    毫升

  底物液（Reagent D） 微升

  專性液（Reagent E）   微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；  反應(yīng)液（Reagent B）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸；  反應(yīng)液（Reagent B）和  底物液（Reagent D），避免光照，有效保證6月

用戶自備

比色皿：用于比色分析的容器

雙波長分光光度儀：用于比色分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；  緩沖液（Reagent A）室溫預(yù)熱；  反應(yīng)液（Reagent B）和  底物液（Reagent D）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好雙波長分光光度儀（溫度為30℃）：波長分別為340nm和380nm，間隔30秒，讀數(shù)7次（共3分鐘），并置零 

• 背景對照測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent B） 
• 加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升  陰性液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：

（340波長讀數(shù)－380波長讀數(shù)）0分鐘－（340波長讀數(shù)－380波長讀數(shù)）1分鐘或3分鐘 

• 樣品總活性測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：

（340波長讀數(shù)－380波長讀數(shù)）0分鐘－（340波長讀數(shù)－380波長讀數(shù)）1分鐘或3分鐘

• 樣品非特異活性測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入xx微升  專性液（Reagent E）
• 加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：

（340波長讀數(shù)－380波長讀數(shù)）0分鐘－（340波長讀數(shù)－380波長讀數(shù)）1分鐘或3分鐘 

• 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為21次（10個樣本）操作，包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至37℃）循環(huán)3次
• 如果增強酶活檢測，建議使用  線粒體復(fù)合物待測樣品預(yù)處理試劑盒－GMS10342
• 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定
• 如果樣本存在明顯干擾，可以選擇進(jìn)行樣本背景對照測定，即不加  反應(yīng)液（Reagent B），加入待測樣品替代  陰性液（Reagent C）
• 通常反應(yīng)1分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)3分鐘
• 測定值由高到低變化，即3分鐘測定讀數(shù)低于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 96孔板測定初始讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)）0.5左右為理想狀態(tài)；比色皿測定為1.0左右
• 如果用戶沒有雙波長同步測定分光光度儀，可以使用單波長340nm替代，注意活性計算時，毫摩爾吸光系數(shù)變成6.2
• 建議待測樣本線粒體蛋白濃度為10微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供  線粒體溶解試劑盒GMS10018為后續(xù)的線粒體蛋白濃度測定的預(yù)處理試劑盒和   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果使用細(xì)胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升
• 樣品特異活性是指魚藤酮敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸－輔酶Q還原酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物II/III/IV等）
• 如果用戶需要研究線粒體呼吸鏈復(fù)合物I總活性包括魚藤酮敏感和抗性之和，請咨詢技術(shù)顧問，另購  補充反應(yīng)液（Reagent B+）
• 線粒體呼吸鏈復(fù)合物I（NADH－輔酶Q還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確