【干貨+試用】一文get核酸片段化酶知識要點(diǎn)

近小翊在后臺收到一封留言，說建庫的片段化儀器壞了，不能做超聲打斷，問有沒有其他核酸打斷的方法推薦。

核酸打斷的方法可以分為機(jī)器法和試劑法。其中機(jī)器法包含接觸式和非接觸式，接觸式主要包括探頭式和水浴超聲兩大類，這類方法比較實(shí)惠，但是直接接觸樣本會導(dǎo)致樣本損耗和污染，非接觸式主要包括Diagennode和Covaris這兩個品牌，這類儀器和耗材的成本太高，單個樣本的耗材成本達(dá)20-50元。試劑法指的是采用片段化酶對核酸進(jìn)行打斷，這類方法成本較低，操作簡便省時，只需要在樣本中加入片段化酶，再反應(yīng)一段時間即可完成反應(yīng)。市面上報道可用于核酸打斷的片段化酶有很多，包括應(yīng)用于高通量測序的Tn5轉(zhuǎn)座酶、NEB公司推出的Fragmentase、DNase I和Endonuclease V等。這里小翊就借花獻(xiàn)佛，將試劑法核酸片段化酶的資料整理出來與大家分享。

DNase Ⅰ

DNase I（Deoxyribonuclease I）：中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5'端為磷酸基團(tuán)，3'端為羥基。DNase Ⅰ酶切底物DNA通常依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。

常見應(yīng)用：

?RNA樣本中DNA的消化

?體外轉(zhuǎn)錄后去除模板DNA

?通過切口平移與DNA聚合酶I一起進(jìn)行DNA標(biāo)記

?dsDNA酶切，生成隨機(jī)的DNA文庫

在鎂離子存在條件下，DNase I隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。

圖 DNase Ⅰ在Mg²⁺以及Mn²⁺存在下可切割dsDNA。圖片來源于Thermo

DNase Ⅰ在不同的離子存在下可以片段化dsDNA，然后實(shí)際操作中卻易受到多種條件的影響，如酶的用量，反應(yīng)溫度，底物DNA的純度等。此外研究發(fā)現(xiàn)DNase Ⅰ對嘧啶核苷酸旁邊位點(diǎn)有偏好性，大大影響終文庫的多樣性^[1]。

Endonuclease V

核酸內(nèi)切酶 V 是在E. coli 中發(fā)現(xiàn)的一種 DNA 修復(fù)酶。其識別脫氧肌苷（脫氧腺苷在DNA中的脫氨基產(chǎn)物），對錯配的脫氧肌苷3′ 端第二個磷酸二酯鍵進(jìn)行切割，產(chǎn)生一個 3′ 羥基、5′ 磷酸的切刻。除此之外在較小程度上可以識別AP位點(diǎn)，基因錯配的DNA位點(diǎn)，插入/缺失不匹配等位點(diǎn)。

常見應(yīng)用：

?突變研究

?DNA修復(fù)

?錯配剪切

?基因分型

?DNA重組

圖 Endonuclease V可識別AP位點(diǎn)或尿素、堿基錯配、插入/缺失錯配、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 DNA。圖片來源于Thermo

2002年，日本學(xué)者Kentaro Miyazaki使用Endonuclease V用于DNA樣本的隨機(jī)片段化。由于Endonuclease V可特異性識別尿嘧啶，因而可以通過調(diào)節(jié)DNA中尿嘧啶的殘留量來控制終Endonuclease V酶切的長度。結(jié)果表明在沒有dUTP的情況下，DNA不會被酶切（Lane 1），當(dāng)dTTP/dUTP的比例降低時，片段的平均長度也隨之降低（Lane 2，3，4），當(dāng)dUTP*替代dTTP的時候，DNA會被切割的很短（Lane 5）^[1]。

圖 不同的dTTP/dUTP濃度比例條件下，DNA被酶切后的片段分布電泳圖

Endonuclease V一般識別特定的位點(diǎn)，本研究中通過PCR隨機(jī)引入尿嘧啶可用于DNA的隨機(jī)片段化。由于堿基序列組成的差異，樣本的GC含量對Endonuclease V片段化效果有潛在影響，實(shí)際操作中尤其是NGS應(yīng)用中也會受到諸多條件的限制。

dsDNA Fragmentase

dsDNA Fragmentase是NEB公司推出的一款片段化酶，以單酶的形式出售。該產(chǎn)品實(shí)際上是兩種酶按一定比例組合成的混合酶體系，一種酶在DNA雙鏈上隨機(jī)產(chǎn)生缺刻，另一種酶識別這個缺刻并在互補(bǔ)鏈上切割，從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。Fragmentase進(jìn)行雙鏈DNA-片段化反應(yīng)后產(chǎn)生帶有5’磷酸和3’羥基的短突出粘性末端DNA -片段。

該酶通過改變酶切時間將DNA酶切至特定大小的DNA -片段，與初始的Input DNA量以及Input DNA長度無關(guān)。

圖 不同起始量的gDNA不同酶切時間后的片段分布。圖片來源于NEB

圖 不同長度的gDNA不同酶切時間后的片段分布。圖片來源于NEB

Tn5

Nextera^XT技術(shù)相信大家都不陌生，2011年1月，Illumina宣布收購Epicentre生物技術(shù)公司，于是理所當(dāng)然的Epicentre公司的Nextera技術(shù)核心也歸illumina公司所有。

Nextera^XT將P5/P7端部分接頭序列和轉(zhuǎn)座子末端序列形成包被接頭與Tn5形成轉(zhuǎn)座復(fù)合體，該復(fù)合體會打斷受體DNA，形成一端帶有P5部分的Adapter1,一端帶有P7部分Adapter2的DNA，之后通過PCR加上index序列以及接頭其余部分，形成完整的文庫，整個建庫流程僅需90 min。

圖 Tn5轉(zhuǎn)座酶建庫原理示意圖

Tn5也借此引爆極速建庫之戰(zhàn)，而競爭對手也并沒有坐以待斃，Thermo用Mu轉(zhuǎn)座酶推出了Museek Library Preparation Kit for Ion Torrent；Agilent 推出Vibrio(哈式弧菌)，Vibrio與Tn5序列之間的相似性高達(dá)40%。盡管如此，其市場反饋以及實(shí)際情況都不如Tn5。

同時Tn5由于其片段化的偏好性經(jīng)常受到競爭對手的詬病。據(jù)統(tǒng)計Tn5在插入位點(diǎn)兩側(cè)9個堿基左右有明顯的偏好性。

圖 轉(zhuǎn)座酶插入位置前后9堿基左右有明顯的偏好性。圖片來源于網(wǎng)絡(luò)

片段化酶小結(jié)

片段化酶與NGS

NGS因其檢測靈敏度高，特異性高且兼具定性和定量檢測，在NIPT，腫瘤基因突變，PGD/PGS等領(lǐng)域展現(xiàn)了極為廣闊的臨床與科研應(yīng)用前景。

然而受限于平臺測序讀長短的不足，建庫前需隨DNA進(jìn)行隨機(jī)打斷。目前主要是以機(jī)械法為主（如Covaris），但是超聲本就是物理方法打斷，會對DNA造成明顯的損傷，且超聲儀器與耗材成本居高不下，這對競爭激烈的NGS下游服務(wù)企業(yè)來說，成本太過高昂。因而這也將是以片段化酶+常規(guī)建庫試劑搭配的酶切法建庫試劑盒進(jìn)入市場的重要契機(jī)。

對于不同的片段化酶來說，Tn5依然是目前市場上極速建庫的wang者，然而另一方面Tn5在建庫中所表現(xiàn)出的偏好性也使得不少的客戶望而卻步。因此像DNase Ⅰ、Endonuclease Ⅴ以及Fragmentase在市場上初露鋒芒，其中DNase Ⅰ與Endonuclease Ⅴ因其各自的不足尚未被*開發(fā)利用，F(xiàn)ragmentase則是目前NGS端為大眾所熟知的片段化酶。

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翊圣生物結(jié)合自身分子酶的創(chuàng)新研發(fā)，推出片段化酶Smearase，本產(chǎn)品酶切效果僅與酶切時間有關(guān)而與樣本類型GC含量以及Input DNA無關(guān)。以此為核心的酶切法建庫試劑盒Hieff NGS^® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina擺脫了繁瑣的超聲過程，同時簡化了操作流程，極大的降低了建庫的時間和成本。并且針對FFPE樣本也能獲得優(yōu)異的測序結(jié)果。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、操作簡便：片段化/末端修復(fù)/加A一步完成

2、穩(wěn)定酶切：酶切效果僅與時間有關(guān)，不受物種類型與Input DNA影響

3、偏好性低：酶切偏好性遠(yuǎn)低于Tn5

4、適用范圍廣：不僅適用于常規(guī)gDNA，cDNA，還適用于FFPE等樣本

性能展示：

圖 不同酶切時間后樣本片段分布情況‘

訂購/試用裝信息：

參考文獻(xiàn)：

Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling. Nucleic Acids Res. 2002 Dec 15;30(24):e139.