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凍干添加劑對PCR體系凍干的影響

來源:蓓迪(北京)科技有限公司   2020年05月27日 07:30  

隨著醫(yī)療事業(yè)的快速發(fā)展,PCR試劑,熒光PCR試劑等的凍干迅速崛起。很多企業(yè)在開發(fā)PCR試劑的凍干。PCR試劑的凍干就是配制的液態(tài)PCR檢測體系添加凍干保護劑(包括賦形劑)后,先預(yù)先凍結(jié)為固體,在真空條件下,利用物質(zhì)的升華,使物料低溫脫水而達到試劑干燥的目的。在冷凍干燥過程中熱敏性物質(zhì)(如酶、dntp等)不會發(fā)生變性或失活,能保持原來的活性;凍干前后試劑體積變化很小,保持了原來的結(jié)構(gòu);干燥過程在真空下進行,氧氣極少,易氧化的物質(zhì)能夠得到保護;冷凍干燥能排除95%~99%以上的水分,使干燥后產(chǎn)品能長期保存而不致變質(zhì)。冷凍干燥整個干燥過程在低溫中進行,PCR試劑活性不會受到影響。因此與常規(guī)液態(tài)PCR試劑相比凍干試劑有著常溫穩(wěn)定、擺脫冷鏈、即時活化、不相容試劑共存、無交叉污染等很多明顯優(yōu)勢。

     所有的凍干包括藥物的凍干和試劑的凍干,原理都是一樣的,都是在含有保護劑的情況下,將我們要保護的試劑或者物質(zhì)進行凍干。其中凍干保護劑起了很大的作用,如果沒有凍干保護劑的添加,很多物質(zhì)是不能完好的凍干的。凍干保護劑使得本來不適合凍干的物質(zhì)能夠獲得良好的凍干狀態(tài)。常見的凍干保護劑包括:糖類、醇類、氨基酸類、聚合物類、表面活性劑類、鹽類、大分子活性物質(zhì)類等,這么多的種類應(yīng)該如何選擇呢?對于凍干保護劑的選擇不一定,凍干的曲線不一樣,凍干的本體物質(zhì)的濃度不一樣,反應(yīng)體系不一樣,所以終凍干的結(jié)果,凍干的時間成本等是不同的。而對于凍干保護劑有些通用的常用的物質(zhì)如海藻糖、蔗糖、甘露醇、PEG、pvp等。但是除了這些常用的還有很多如甘油、乳糖、半乳糖、組氨酸、精氨酸、甘氨酸、右旋糖苷、吐溫80、吐溫100、環(huán)糊精、明膠、維生素C、維生素B、牛血清、二硫蘇糖醇、吐溫20、明膠等,這些都是很好的凍干保護劑或者賦形劑。因此對于同一個試劑的凍干可以選擇的凍干保護劑是很多的。

  凍干保護劑的篩選看似簡單,但是需要大量的工作量,如果想獲得一個高效穩(wěn)定的PCR凍干體系,需要進行大量的實驗,保護劑的篩選實驗,凍干曲線的優(yōu)化實驗等。先選擇種類濃度,再進行優(yōu)化組合。同樣組分的保護劑用在不同的PCR反應(yīng)體系可能凍干的曲線,凍干的質(zhì)量都會有差別,這是由于本體物質(zhì)不一樣,實驗的條件也不*一樣,因此對于凍干沒有一個通用的保護劑,需要針對自身的反應(yīng)體系進行開發(fā)。

叔丁醇是一種特殊的凍干保護劑加速劑,可以起到凍干保護劑、賦形劑和加速劑的作用。如《一種凍干添加劑及熒光PCR反應(yīng)混合物干粉 和制備方法》所述加入叔丁醇做保護劑的熒光pcr反應(yīng)體系的效率能大大提高,而且預(yù)凍溫度,升華溫度,解析溫度都能大大提高,如作者所述叔丁醇在PCR試劑分裝好準備凍干之前按體積比加入, 混合后可提高混合物共晶點15-20度,在凍干顯微鏡下,叔丁醇升華后形成的微通道有利于 水分的析出,也加快了升華解析的速度。通過對保護劑的篩選優(yōu)化,熒光PCR反應(yīng)混合物含有凍干添加劑,不僅擴增性能好,又節(jié)省凍干時 間,顯著的優(yōu)點在于: 1、提高了共晶點,預(yù)凍溫度從常見的-40℃~-30℃提高到-15℃; 2、凍干時間僅需3小時;3、凍干的成品在試劑管中形態(tài)完整,晃動不易碎; 4、凍干組分復(fù)溶良好,并且有良好的穩(wěn)定性。從以上可以看出經(jīng)過優(yōu)化的凍干保護劑和凍干曲線效率大大提高,而對于常規(guī)的保護劑未優(yōu)化的保護劑和凍干曲線,一般的PCR反應(yīng)體系的凍干時間在24小時,而經(jīng)過優(yōu)化篩選后效率可以大大提高,而對于有的可能酶的凍存過程中添加了一定的保護劑,保護劑濃度合適可能不需要再添加保護劑也可以很容易的凍干。凍干保護劑屬于凍干配方輔料的篩選,對于很多物質(zhì)的凍干是*的。制藥和試劑凍干基本上都需要添加一種或者多種保護劑。

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