干貨分享|磁珠常見問題與解決方案

高通量測序技術(shù)的跨越式發(fā)展，使測序能力大幅上升。在整個NGS工作流程中，磁珠是*的產(chǎn)品。

磁珠通過磁顆粒活性基團在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，將樣本中目的片段分離?？蓪崿F(xiàn)對核酸樣本的高通量自動化操作，廣泛應(yīng)用于基因測序以及分子診斷領(lǐng)域。

看起來很簡單的純化/分選實驗，卻在實際實驗中有各種意外的情況。那關(guān)于磁珠產(chǎn)品選擇和產(chǎn)品使用方面有什么需要注意的事項呢？接下來小翊將從磁珠的外觀、儲存、應(yīng)用和使用效果逐一對癥分析，希望能幫助大家了解磁珠實驗中的那些事。

磁珠外觀

Q：如何從磁珠的外觀區(qū)分磁珠是否正常？

A：正常磁珠靜置時，微珠與buffer分層，聚集在瓶身底部，使用前震蕩混勻，微珠均勻分布在buffer中。非正常磁珠由于 β-巰基乙醇、DTT、pH差值大等因素，影響磁珠的均一性，使得磁珠粘稠，聚集成塊或出現(xiàn)掛壁的現(xiàn)象。

圖1：正常磁珠外觀圖

圖2：非正常磁珠外觀圖

磁珠儲存

Q： 不小心將磁珠放到-20℃，但未結(jié)冰，是否可以繼續(xù)使用？

A：不建議使用。因為低溫會破壞磁珠的結(jié)構(gòu)，使得磁珠的抓取效率降低，影響磁珠回收性能。

Q：磁珠未開封的時候4℃保存，開封后一直室溫保存使用，是否會影響磁珠的回收性能？

A：室溫放置對磁珠的回收性能會有一定影響，不建議室溫放置太久，使用完后建議4℃保存。PEG分離效果易受pH、溫度等影響。

磁珠應(yīng)用

Q：磁珠分選的原理是什么？

A：第—輪磁珠結(jié)合分子量較大的DNA，通過丟棄磁珠去除這部分產(chǎn)物；第二輪磁珠結(jié)合剩余產(chǎn)物中分子量較大的DNA，通過丟棄上清去除分子量較小的DNA。

初始樣品中的很多組分都會干擾雙輪磁珠分選效果。因此，當(dāng)分選方案執(zhí)行位置不同時，雙輪磁珠使用量也不盡相同。

Q：產(chǎn)品的主要應(yīng)用是什么？
A：產(chǎn)品主要應(yīng)用于高通量測序DNA///片段的純化和分選。對于PCR或者酶切DNA產(chǎn)物的純化也可以使用?？梢杂行コ齞NTP，引物，引物二聚體，接頭，接頭二聚體，鹽離子等雜質(zhì)。

Q：產(chǎn)品可以重復(fù)使用嗎？
A：產(chǎn)品不可以重復(fù)使用，乙醇洗脫步驟將影響磁珠表面活性基團性能。

Q：與AMPure XP相比，怎么樣？
A：我們的產(chǎn)品制備原材料*進口，可以完美替代AMPure XP Beads。在使用方法，文庫大小分布和回收效率上，與AMPure XP Beads*一致，您可以直接按照AMPure XP Beads的操作方式使用，無需摸索條件。

Q： 磁珠可以吸附ssDNA嗎？

A：可以回收單鏈DNA，具體性能沒有測試過。附圖是Beckman磁珠回收單鏈DNA的數(shù)據(jù)，可以作為參考。

圖3：XP磁珠回收單鏈DNA效果圖

Q： 分選磁珠可以純化gDNA嗎？

A：翊圣分選磁珠測試過大20kb的片段，回收率>90%?；蚪M DNA 未測試過，測試時，由于大DNA與磁珠結(jié)合的非常緊，建議盡量增加洗脫液體積，避免干燥時間過久。

Q: 分選磁珠是否可以進行片段產(chǎn)物純化？

A: 根據(jù)客戶反饋結(jié)果，分選磁珠可以進行片段產(chǎn)物的純化。0.8×磁珠可以吸附 200 bp 以上的產(chǎn)物，通過去除上清即可對 200 bp 以下的片段進行去除；1.4×磁珠可以吸附 150 bp 以上的產(chǎn)物，通過去除上清即可對 150 bp 以下的片段進行去除。

Q：磁珠的DNA結(jié)合能力怎么樣？

A：在目前的磁珠體系中，磁珠的吸附能力均為過飽和，客戶不必擔(dān)心磁珠結(jié)合能力不足的情況。根據(jù)已知的報道，每1 μL磁珠可以結(jié)合7 μg DNA。

Q： 使用磁珠吸附小片段的時候，大片段也會吸附上來嗎？

A: 磁珠優(yōu)先吸附大片段，增大磁珠投入量時，磁珠會在吸附大片段的基礎(chǔ)上增強吸附小片段的能力。

舉例說明：參考磁珠純化分選表，100 μL樣本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此時磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，當(dāng)磁珠投入量至100 μL時，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

Q：分選磁珠是否可以用于提取DNA？

 A：使用分選磁珠可以實現(xiàn)直接將樣本裂解后用磁珠將其中的gDNA提取出來，可能效率沒有試劑盒的高，因為我們這款磁珠的定位是在純化和分選。

磁珠使用效果

Q：使用磁珠分選/純化之后，還有小片段殘留是怎么回事？

圖4：二聚體殘留效果圖

A：小片段殘留大部分是接頭二聚體（127bp）/引物二聚體（80bp）。若純化，降低磁珠比例；若分選：可適當(dāng)降低二輪磁珠比例可有效改善此類情況。

Q：磁珠回收率低可能的原因是什么？

A：1）磁珠與DNA混勻不充分，未能充分吸附。建議反應(yīng)體系充分混勻；

2）磁珠比例不對，建議按照說明書進行選擇合適的比例；

3）孵育時間不足，保證孵育時間至少5 min；

4）磁珠分選時，二輪磁珠吸附的時候吸到磁珠?？稍?00 μL 槍頭前串聯(lián) 10μL槍頭用于移液，可防止吸到磁珠；

5）磁珠洗滌時的乙醇非現(xiàn)配，導(dǎo)致乙醇濃度過低，建議乙醇濃度不低于70%；

6）干燥過度：磁珠長時間干燥導(dǎo)致表面龜裂，DNA難以洗脫，得率降低；建議干燥時間不宜過長，表面剛出現(xiàn)龜裂即可；

7）洗脫液體積不足：終洗脫液應(yīng)*覆蓋管內(nèi)磁珠。

Q：純化后DNA在后續(xù)實驗中表現(xiàn)不理想。
A：由乙醇殘留引起，可能是操作時磁珠分離時間過短或磁力器磁力較弱，洗脫步驟中吸取上清速度過快等。建議確保在后一步洗滌結(jié)束后，溶液中無殘留乙醇。磁珠可于室溫干燥5-10分鐘，使乙醇*干燥。

Q: 使用 12601 分選磁珠，分選出的文庫大小不對稱是怎么回事？

圖5：分選文庫大小不對稱效果圖

A：操作問題，磁珠比例應(yīng)嚴(yán)格按照說明書，另外移液時為避免吸到磁珠，底部需殘留 1-2μL 液體。

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