漲知識(shí)！對(duì)于PCR你真的知道么？

PCR技術(shù)作為分子生物學(xué)基礎(chǔ)的研究方法之一。20世紀(jì)80年代凱利·穆利斯發(fā)明第—代PCR技術(shù)以來(lái)，“變性、退火、延伸”三部曲從未停歇。歷經(jīng)三十多年的演變，PCR技術(shù)已衍生出眾多變體。小翊總結(jié)了一代PCR的一些常見(jiàn)類(lèi)型，助力您的科學(xué)研究。

常規(guī)PCR

常規(guī)PCR一般是由Taq DNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，操作較為簡(jiǎn)便，產(chǎn)物帶有A尾。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析。兼容樣本范圍廣，但保真性低，主要應(yīng)用于常規(guī)重組質(zhì)粒驗(yàn)證和基因型鑒定等方面。

常規(guī)PCR產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱(chēng)：2×Hieff® Robust PCR Master Mix (With Dye)  

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1）延伸速度快（15-30s/kb），極限速度達(dá)5s/kb。

2）模板適用性更廣泛，靶基因GC耐受范圍35-70%。

圖1. 以小鼠基因組為模板，分別擴(kuò)增1-4kb的片段。

高保真PCR

高保真PCR一般是由保真性較高的DNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)。第—代高保真DNA聚合酶是從棲熱原始菌Pyrococcus furiosus中獲得的具有校正功能的pfu酶，與常規(guī)Taq酶相比多了一種3’-5’的核酸外切酶活性（Proofreading活性），保真性大大提高且擴(kuò)增的產(chǎn)物通常為平末端。目前主要有2類(lèi)產(chǎn)品：一類(lèi)是混合型的高保真酶，將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶混合用于提高擴(kuò)增效率；另一類(lèi)是單一型的高保真酶，保真性更高。

翊圣Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶基于Pfu，經(jīng)基因工程改造而成。酶溶液中添加了*的反應(yīng)增強(qiáng)因子、熱啟動(dòng)因子和延伸因子，極大提高了擴(kuò)增的成功率，特異性和延伸速度。對(duì)于高保真PCR應(yīng)用而言，具有高保真性、高成功率、高特異性的Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶是理想選擇。

高保真PCR產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱(chēng)：Hieff Canace® Gold PCR Master Mix

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1）保真性高，是Taq酶的52倍，pfu酶的6倍。

2）超高特異性。

3）高靈敏：可擴(kuò)增低至1 pg模板。

圖2. 5種品牌的高保真DNA聚合酶擴(kuò)增2 kb，4 kb的小鼠gDNA。Y：Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶；A-E：其他品牌的高保真DNA聚合酶。

熱啟動(dòng)PCR

熱啟動(dòng)PCR，也稱(chēng)Hotstart PCR。指通過(guò)一定條件將DNA聚合酶與其他PCR反應(yīng)物隔絕，使其低溫條件下無(wú)活性，高溫加熱后釋放酶活，進(jìn)而避免出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物。熱啟動(dòng)PCR的關(guān)鍵是熱啟動(dòng)型的DNA聚合酶，一般通過(guò)抗體、配體或化學(xué)修飾等來(lái)封閉酶活性中心，不同的熱啟動(dòng)修飾方法原理上有所區(qū)別，各有優(yōu)劣勢(shì)（見(jiàn)下表）。通常應(yīng)用于復(fù)雜模板、低拷貝基因擴(kuò)增，也是IVD試劑的核心原料。

熱啟動(dòng)PCR產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱(chēng)：Hieff UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase （抗體法熱啟動(dòng)Taq酶）

產(chǎn)品特點(diǎn)：抗體法修飾，親和力強(qiáng)，靈敏度高，特異性好。

直擴(kuò)PCR

直擴(kuò)PCR技術(shù)，是以未經(jīng)基因組純化的微量原始樣本或其裂解產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。廣泛適用于血液樣本、植物和動(dòng)物等組織，與常規(guī)PCR相比，樣本用量少、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)成本低、可高通量化操作。可應(yīng)用于基因分型、轉(zhuǎn)基因鑒定等實(shí)驗(yàn)。

翊圣直擴(kuò)PCR系列產(chǎn)品運(yùn)用*的裂解體系，快速裂解樣品，裂解液可直接作為模板，搭配試劑盒中的具有*抑制物耐受性的Taq DNA聚合酶進(jìn)行基因的擴(kuò)增。

圖3.組織直擴(kuò)系列流程圖

小鼠直擴(kuò)PCR產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱(chēng)：Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 小鼠組織直接PCR試劑盒（Cat#10185）

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1）樣本需要量少：5mg鼠組織或1-5mm鼠尾。

2）模板制備更方便：無(wú)需研磨，無(wú)需精提純化gDNA。

3）優(yōu)化的PCR體系：具有更高的特異性、更強(qiáng)的 PCR 反應(yīng)抑制物耐受性。

圖4.適合不同類(lèi)型的小鼠粗提組織

多重PCR

多重PCR，也稱(chēng)復(fù)合PCR。反應(yīng)原理、反應(yīng)過(guò)程與常規(guī)PCR無(wú)異，需要在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，使用多對(duì)引物對(duì)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適，引物對(duì)的數(shù)量可以不限，但實(shí)際由于各種條件的限制，實(shí)際能夠擴(kuò)增的產(chǎn)物有限。多重PCR反應(yīng)體系的組成和PCR循環(huán)的條件需經(jīng)過(guò)優(yōu)化以確保同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)片段。具有性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，難點(diǎn)是反應(yīng)體系各組分的平衡。主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或癌基因的分型。

圖5.多重PCR原理圖

多重PCR產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱(chēng)：Hieff® Multiplex  PCR Kit  

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1）擴(kuò)增子大?。哼m合50bp-1.5kb的擴(kuò)增子。

2）均一性好：靶點(diǎn)偏好性極低。

3）特異性強(qiáng)：///大程度抑制非特異性擴(kuò)增；

4）靈敏度高：可擴(kuò)增低至1ng模板；

5）擴(kuò)增重?cái)?shù)：可達(dá)20-1000重。

圖6. 以人gDNA模板，進(jìn)行10重PCR，可檢測(cè)低至1ng的模板

巢式PCR

巢式PCR是指利用兩對(duì)引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)。首先使用目的片段外圍的引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用內(nèi)部的巢式引物同時(shí)將第—輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增的模板。第二次PCR擴(kuò)增得到的目的片斷短于第—次擴(kuò)增。

翊圣GMyc-PCR 支原體檢測(cè)試劑盒基于支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域利用巢式PCR法原理可檢測(cè)到常見(jiàn)的支原體污染。主要應(yīng)用于病毒檢測(cè)、測(cè)序分析、低表達(dá)基因檢測(cè)等。

巢式PCR產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱(chēng)：GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit GMyc-PCR支原體檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品特點(diǎn)：檢測(cè)多種支原體類(lèi)型，檢測(cè)限低至單拷貝。

圖7. 巢式PCR擴(kuò)增含不同濃度支原體樣品。

降落PCR

降落PCR，又稱(chēng)Touch-down PCR。通過(guò)設(shè)置PCR程序中的退火溫度，一般開(kāi)始時(shí)高于預(yù)設(shè)的Tm值，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，退火溫度逐漸降低到Tm值，并終低于該溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過(guò)反應(yīng)程序中退火溫度的設(shè)置，極大程度上降低了引物與模板的非特異性結(jié)合。主要用于PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化，提高產(chǎn)物特異性。

常見(jiàn)的PCR類(lèi)型介紹就到這里了。當(dāng)然，除了上述介紹的PCR形式，還有錨定PCR、原位PCR等不同的PCR類(lèi)型，如感興趣可自行查閱或留言哦！

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