防已染料法PCR鑒定試劑盒反應(yīng)的特異性決定因素:
1.引物與模板DNA特異正確的結(jié)合。
2.堿基配對(duì)原則。
3. Tag DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性。
4.靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及 Tag DNA聚合醇耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結(jié)合的特異性大大増加加,被擴(kuò)増的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。
靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式増加的,能將皮克(pg=10-129)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)増到微克(ug=10-69)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞;在病毒的檢測(cè)中,PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中zu小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
(3)簡(jiǎn)便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的 Tag DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)増液和水浴鍋上進(jìn)行變性退火-延伸反應(yīng),一般在2-4小時(shí)完成擴(kuò)増反應(yīng)。擴(kuò)増產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4)對(duì)標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)増模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。