干貨分享|酶切法DNA建庫(kù)“十問(wèn)實(shí)答”，助您建庫(kù)無(wú)憂

第二代測(cè)序(NGS)技術(shù)迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的科研工作者采用NGS技術(shù)作為課題研究的主要手段。NGS過(guò)程中，基因文庫(kù)的質(zhì)量直接影響后續(xù)的測(cè)序工作，因此構(gòu)建基因文庫(kù)是整個(gè)測(cè)序過(guò)程中///為關(guān)鍵的步驟。其中酶切法DNA文庫(kù)構(gòu)建，越來(lái)越多的獲得廣大科研人員的青睞。相信在運(yùn)用酶切法構(gòu)建DNA文庫(kù)的過(guò)程中，大家或多或少的會(huì)遇到各種問(wèn)題。

他山之石，可以攻玉！接下來(lái)小翊帶領(lǐng)大家一起解決實(shí)驗(yàn)開展前后的可能遇到的各種困惑。

實(shí)驗(yàn)開展前，“千頭萬(wàn)緒”

1、DNA文庫(kù)構(gòu)建方法的選擇：為什么酶切法建庫(kù)如此備受青睞？

酶切法構(gòu)建DNA文庫(kù)，相較于傳統(tǒng)的超聲法和轉(zhuǎn)座酶法具有以下優(yōu)勢(shì)：

• 無(wú)偏好片段化酶：具有穩(wěn)定的片段化效果，無(wú)需復(fù)雜的機(jī)械片段化過(guò)程。酶切產(chǎn)物片段大小同樣本類型、Input DNA量和GC含量等均無(wú)相關(guān)性，僅與酶切時(shí)間有關(guān)。
• 建庫(kù)流程精簡(jiǎn)：一步完成片段化/末端修復(fù)/加A ，片段化/末端修復(fù)/加A （30min）-接頭連接（15min）-純化/分選（30min）-文庫(kù)擴(kuò)增（15min）-純化分選（30min），常規(guī)建庫(kù)預(yù)計(jì)耗時(shí)約2h，PCR-free建庫(kù)預(yù)計(jì)耗時(shí)1h。
• 寬泛的樣本投入范圍：相比較固定投入量，固定酶切時(shí)間的TN5建庫(kù)，酶切法建庫(kù)適用500 pg-1 μg，滿足個(gè)性化建庫(kù)。

圖1.翊圣Onepot系列酶切法建庫(kù)優(yōu)勢(shì)

2. 酶切法建庫(kù)運(yùn)用的是什么酶，類似限制性酶切酶嗎，具體如何打斷DNA呢？

不同于限制性酶切酶，片段化酶是隨機(jī)內(nèi)切酶，不受特定酶切位點(diǎn)的限制，隨機(jī)切割對(duì)應(yīng)模板DNA，片段化的產(chǎn)物屬于粘性末端，后續(xù)需要進(jìn)行末端修復(fù)。

舉例：投入500 pg-1000 ng的正常人類基因組DNA，30 ℃ 15min, 可將DNA酶切為150-550 bp左右的長(zhǎng)度。

3. 酶切法建庫(kù)適合哪些應(yīng)用研究嗎，對(duì)樣本具有普適性嗎？

片段化酶酶切法建庫(kù)可適用全基因組測(cè)序（含PCR-free文庫(kù)構(gòu)建）、全外顯子測(cè)序、靶向捕獲測(cè)序、宏基因組測(cè)序等。適合樣本類型是gDNA、cDNA和高質(zhì)量的FFPE樣本等，不適合cfDNA（cfDNA無(wú)需打斷）。

4、酶切法建庫(kù)試劑盒針對(duì)哪些樣本建庫(kù)效果比較好？

兼容范圍為500 pg – 1μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA?；蚪MDNA和cDNA均可獲得高產(chǎn)高質(zhì)的文庫(kù)。

舉例：

展示為翊圣onepot II系列12204應(yīng)用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建（ds-cDNA）

背景：客戶得到逆轉(zhuǎn)錄的ds-cDNA，全長(zhǎng)1.1kb左右，想酶切至300 bp左右。

結(jié)論：Input DNA 50 ng左右，酶切4-10 min，PCR 8Cycles，產(chǎn)量>3μg,若需要更集中的文庫(kù)，可進(jìn)行雙輪分選。

5、對(duì)于不同類型的DNA樣本，酶切時(shí)間如何控制？

對(duì)于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時(shí)間如下：

當(dāng)然了，為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，建議在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào)。

實(shí)驗(yàn)開展后，“五味陳雜”

6、gDNA///片段化參考說(shuō)明書酶切條件酶切20 min，竟然切不動(dòng)？

一般優(yōu)先考慮DNA的質(zhì)量問(wèn)題，比如 Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽離子，可能會(huì)影響酶切效果，建議將DNA稀釋在ddH₂O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再進(jìn)行片段化。其次，如果樣本是反轉(zhuǎn)錄得到的全長(zhǎng)cDNA，則需考慮樣本純度問(wèn)題。另外，對(duì)于環(huán)狀DNA的酶切，需要另行摸索酶切時(shí)間體系。特殊樣本可考慮磁珠純化之后進(jìn)行酶切或適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間。

備注：紅色曲線表示，30度酶切20 min未切開

7、FFPE樣本，酶切時(shí)間太難控制了？

*，F(xiàn)FPE樣本雖然使組織得以長(zhǎng)期保存，但其特殊的制作方法和保存過(guò)程對(duì)核酸分子造成多方面的影響：核酸與蛋白交聯(lián)、降解嚴(yán)重等諸多問(wèn)題。我們先來(lái)看下不同質(zhì)量的FFPE樣本，采用相同的酶切條件影響有多大。

舉例：相同酶切條件下，質(zhì)量高的樣本酶切效果較好，滿足需求（樣本4），質(zhì)量差的樣本出現(xiàn)過(guò)度酶切現(xiàn)象，酶切片段偏?。颖?/span>1/3）

因此對(duì)于不同降解程度的FFPE樣本，建議做好質(zhì)量控制，對(duì)樣本進(jìn)行分層級(jí)，不同層級(jí)的推薦酶切時(shí)間參考下表。對(duì)FFPE樣本，建議搭配翊圣FFPE修復(fù)試劑FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606).

備注：FFPE樣本DNA質(zhì)量也可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳膠圖簡(jiǎn)單判斷，高質(zhì)量樣本-DNA質(zhì)量大于10kb，條帶明亮單一，建議酶切10 min左右；一般質(zhì)量樣本-膠圖顯示無(wú)明顯主帶，整體彌散條帶，建議酶切6-8 min；質(zhì)量較差樣本-膠圖無(wú)主帶，整體條帶弱，建議酶切2 min；極差FFPE樣本，建議可不酶切，搭配FFPE修復(fù)試劑直接建庫(kù)。

8、DNA酶切后出現(xiàn)大片段殘留？

酶切產(chǎn)物出現(xiàn)大片段殘留現(xiàn)象，考慮Input DNA純度外（參考FAQ 6），建議適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間。

9、酶切時(shí)間也不長(zhǎng)，竟然過(guò)度酶切了?

以插入片段300 bp為例，白細(xì)胞gDNA，30 度酶切10min，出現(xiàn)如下圖過(guò)度酶切現(xiàn)象。建議參考酶切條件需要考慮不同樣本gDNA大小，如白細(xì)胞gDNA較小，應(yīng)適當(dāng)縮短酶切時(shí)間，否則易出現(xiàn)如下過(guò)度酶切現(xiàn)象。

10、酶切法建庫(kù)，如何做到較好的質(zhì)量控制？

1）文庫(kù)濃度檢測(cè)，qubit法或qPCR ；

2）文庫(kù)長(zhǎng)度檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定；

3）文庫(kù)質(zhì)量鑒定，Agilent 2100/2200；

4）文庫(kù)大小分布、引物二聚體和過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失，應(yīng)通過(guò)電泳方法進(jìn)行確認(rèn).

構(gòu)建優(yōu)異的DNA文庫(kù)，除了明確以上因素之外，還需要選擇高質(zhì)量的建庫(kù)產(chǎn)品。翊圣生物為滿足廣大科研工作者的NGS建庫(kù)實(shí)驗(yàn)需求，推出了NGS建庫(kù)整體解決方案，方便大家根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。