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干貨分享|酶切法DNA建庫“十問實答”,助您建庫無憂

來源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2020年06月28日 19:07  

干貨分享|酶切法DNA建庫“十問實答”,助您建庫無憂

 

第二代測序(NGS)技術(shù)迅猛發(fā)展,越來越多的科研工作者采用NGS技術(shù)作為課題研究的主要手段。NGS過程中,基因文庫的質(zhì)量直接影響后續(xù)的測序工作,因此構(gòu)建基因文庫是整個測序過程中///為關(guān)鍵的步驟。其中酶切法DNA文庫構(gòu)建,越來越多的獲得廣大科研人員的青睞。相信在運(yùn)用酶切法構(gòu)建DNA文庫的過程中,大家或多或少的會遇到各種問題。

他山之石,可以攻玉!接下來小翊帶領(lǐng)大家一起解決實驗開展前后的可能遇到的各種困惑。

 

實驗開展前,“千頭萬緒”

 

1、DNA文庫構(gòu)建方法的選擇:為什么酶切法建庫如此備受青睞?

酶切法構(gòu)建DNA文庫,相較于傳統(tǒng)的超聲法和轉(zhuǎn)座酶法具有以下優(yōu)勢:

  • 無偏好片段化酶:具有穩(wěn)定的片段化效果,無需復(fù)雜的機(jī)械片段化過程。酶切產(chǎn)物片段大小同樣本類型、Input DNA量和GC含量等均無相關(guān)性,僅與酶切時間有關(guān)。
  • 建庫流程精簡:一步完成片段化/末端修復(fù)/加A 片段化/末端修復(fù)/加A (30min)-接頭連接(15min)-純化/分選(30min)-文庫擴(kuò)增(15min)-純化分選(30min),常規(guī)建庫預(yù)計耗時約2h,PCR-free建庫預(yù)計耗時1h。
  • 寬泛的樣本投入范圍相比較固定投入量,固定酶切時間的TN5建庫,酶切法建庫適用500 pg-1 μg,滿足個性化建庫

 

圖1.翊圣Onepot系列酶切法建庫優(yōu)勢

 

2. 酶切法建庫運(yùn)用的是什么酶,類似限制性酶切酶嗎,具體如何打斷DNA呢?

不同于限制性酶切酶,片段化酶是隨機(jī)內(nèi)切酶,不受特定酶切位點的限制,隨機(jī)切割對應(yīng)模板DNA,片段化的產(chǎn)物屬于粘性末端,后續(xù)需要進(jìn)行末端修復(fù)。

舉例:投入500 pg-1000 ng的正常人類基因組DNA,30  15min, 可將DNA酶切為150-550 bp左右的長度。

 

3. 酶切法建庫適合哪些應(yīng)用研究嗎,對樣本具有普適性嗎?

片段化酶酶切法建庫可適用全基因組測序(含PCR-free文庫構(gòu)建)、全外顯子測序、靶向捕獲測序、宏基因組測序等。適合樣本類型是gDNA、cDNA和高質(zhì)量的FFPE樣本等,不適合cfDNA(cfDNA無需打斷)

4、酶切法建庫試劑盒針對哪些樣本建庫效果比較好?

兼容范圍為500 pg – 1μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA?;蚪MDNA和cDNA均可獲得高產(chǎn)高質(zhì)的文庫。

舉例:

展示為翊圣onepot II系列12204應(yīng)用于cDNA文庫構(gòu)建(ds-cDNA)

背景:客戶得到逆轉(zhuǎn)錄的ds-cDNA,全長1.1kb左右,想酶切至300 bp左右。

結(jié)論:Input DNA 50 ng左右,酶切4-10 min,PCR 8Cycles,產(chǎn)量>3μg,若需要更集中的文庫,可進(jìn)行雙輪分選。

 

 

5、對于不同類型的DNA樣本,酶切時間如何控制?

對于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA,酶切時間如下:

當(dāng)然了,為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果,建議在自己的實驗體系中進(jìn)行微調(diào)。

 

實驗開展后,“五味陳雜”

 

6、gDNA///片段化參考說明書酶切條件酶切20 min,竟然切不動?

一般優(yōu)先考慮DNA的質(zhì)量問題,比如 Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽離子,可能會影響酶切效果,建議將DNA稀釋在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再進(jìn)行片段化。其次,如果樣本是反轉(zhuǎn)錄得到的全長cDNA,則需考慮樣本純度問題。另外,對于環(huán)狀DNA的酶切,需要另行摸索酶切時間體系。特殊樣本可考慮磁珠純化之后進(jìn)行酶切或適當(dāng)延長酶切時間。

 

備注:紅色曲線表示,30度酶切20 min未切開

 

7、FFPE樣本,酶切時間太難控制了?

*,F(xiàn)FPE樣本雖然使組織得以長期保存,但其特殊的制作方法和保存過程對核酸分子造成多方面的影響:核酸與蛋白交聯(lián)、降解嚴(yán)重等諸多問題。我們先來看下不同質(zhì)量的FFPE樣本,采用相同的酶切條件影響有多大。

舉例:相同酶切條件下,質(zhì)量高的樣本酶切效果較好,滿足需求(樣本4),質(zhì)量差的樣本出現(xiàn)過度酶切現(xiàn)象,酶切片段偏小(樣本1/3

 

因此對于不同降解程度的FFPE樣本,建議做好質(zhì)量控制,對樣本進(jìn)行分層級,不同層級的推薦酶切時間參考下表。對FFPE樣本,建議搭配翊圣FFPE修復(fù)試劑FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606).

備注:FFPE樣本DNA質(zhì)量也可通過瓊脂糖凝膠電泳膠圖簡單判斷,高質(zhì)量樣本-DNA質(zhì)量大于10kb,條帶明亮單一,建議酶切10 min左右;一般質(zhì)量樣本-膠圖顯示無明顯主帶,整體彌散條帶,建議酶切6-8 min;質(zhì)量較差樣本-膠圖無主帶,整體條帶弱,建議酶切2 min;極差FFPE樣本,建議可不酶切,搭配FFPE修復(fù)試劑直接建庫。

8、DNA酶切后出現(xiàn)大片段殘留?

酶切產(chǎn)物出現(xiàn)大片段殘留現(xiàn)象,考慮Input DNA純度外(參考FAQ 6),建議適當(dāng)延長酶切時間。

 

9、酶切時間也不長,竟然過度酶切了?

以插入片段300 bp為例,白細(xì)胞gDNA,30 度酶切10min,出現(xiàn)如下圖過度酶切現(xiàn)象。建議參考酶切條件需要考慮不同樣本gDNA大小,如白細(xì)胞gDNA較小,應(yīng)適當(dāng)縮短酶切時間,否則易出現(xiàn)如下過度酶切現(xiàn)象。

 

 

10、酶切法建庫,如何做到較好的質(zhì)量控制?

 

1)文庫濃度檢測,qubit法或qPCR ;

2)文庫長度檢測,瓊脂糖凝膠電泳測定;

3)文庫質(zhì)量鑒定,Agilent 2100/2200;

4)文庫大小分布、引物二聚體和過擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失,應(yīng)通過電泳方法進(jìn)行確認(rèn).

 

構(gòu)建優(yōu)異的DNA文除了明確以上因素之外,還需要選擇高質(zhì)量的建庫產(chǎn)品。翊圣生物為滿足廣大科研工作者NGS建庫實驗需求,推出了NGS建庫整體解決方案,方便大家根據(jù)實驗需求進(jìn)行選擇。

 

試劑類別

產(chǎn)品名稱

貨號

規(guī)格

目錄價/元

*/元

建庫試劑盒

Illumina平臺

 

Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® 一步法DNA建庫試劑盒

12203ES08/24/96

8/24/96 T

3656/7486/28567

2194/4492//17140

Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for Illumina® 一步法DNA建庫試劑盒

12204ES08/24/96

8/24/96 T

3683/7583/28663

2210/4550/17198

建庫試劑盒

華大MGI平臺

 

Hieff  NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI

13331ES16/96

16/96 T

5363/26563

3486/17266

磁珠

Hieff NGS® DNA Selection Beads 分選磁珠(完美替代AMPure XP Beads)

12601ES03/08/56/75

1/5/60/450 ml

296/986/6286/26186

192/641/4086/17021

接頭

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina® Set1/2/3/4

12615/6/7/

12618ES04/16

12×4 T/12×16 T

1256/4536

816/2948

定量

dsDNA HS Assay Kit for Qubit®

12640ES60/76

100/500T

686/2696

446/1752

1×dsDNA HS Assay Kit for Qubit®

12642ES60/76

100/500T

853/2983

554/1939

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