谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)

試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：正是測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1 支，-20℃保存。

混合試劑配制：臨用前，在試劑二中加入試劑一40 mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三，混勻。（注意：必須現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)天使用完）

試劑四：液體×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，從而保護生物膜免受ROS 的損害，維持細胞的正常功能；而且具有保護肝臟、提高機體免疫力、拮抗有害金屬離子對機體的傷害和增加機體抗輻射等能力。

GSH-Px 催化H₂O₂氧化GSH，產(chǎn)生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH 還原GSSG，再生GSH，同時NADPH 氧化生成NADP⁺；NADPH 在340 nm有特征吸收峰，而NADP⁺沒有；通過測定340 nm光吸收減少速率來計算GSH-Px 活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）:試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取0.1g 組織，加入1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量10⁴個：試劑一體積（ml）500~1000:1 的比例,建議500 萬細胞加入1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（率300w，超聲3 s，間隔7s，總時間3min）然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

二、測定操作:

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 混合試劑在25℃或者37℃（哺乳動物）水浴中預(yù)熱30min 以上。

3. 空白管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL 蒸餾水、800μL 預(yù)熱的混合試劑，100μL試劑四，迅速混勻后于340nm處測定第10 s和第190s的吸光值，分別記為A空1和A空2，△A 空白管= A空1﹣A空2。

4. 測定管：依次在1mL 石英比色皿中加入100μL 上清液、800μL 預(yù)熱的混合試劑，100μL試劑四，迅速混勻后于340nm 處測定第10 s和第190s 的吸光值，分別記為 A測1 和A測2，△A 測定管= A測1﹣A測2。

注意：空白管只需測定一次。

三、GSH-Px 活性計算：

(1). 按蛋白濃度計算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每 mg 蛋白每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (U/mg prot)=[(△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（ Cpr×V 樣）÷T

=536×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每g 樣本每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (U/g)=[(△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（W×V 樣÷V樣總）÷T

=536×(△A 測定管-△A 空白管)÷W

(3). 按細胞數(shù)量計算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (U/10⁴ cell)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

=536×(△A測定管-△A空白管)÷細胞數(shù)量

(4). 按液體體積計算

GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GSH-Px (U/ml)=[(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷V 樣÷T

=536×(△A測定管-△A空白管)

ε:NADPH 摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1000μL=0.001 L；

10⁶：1mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體，100μL =0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，3min。

注意事項：

1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當(dāng)日測定酶活力。

2. 混合試劑和底物液須臨用前配制，配完后置于冰上，當(dāng)天使用完。

3. 測定過程操作須迅速。

4. 細胞中GSH-Px 活性測定時，細胞數(shù)目須在300 萬-500 萬之間，細胞中GSH-Px 的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

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