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共聚焦顯微鏡是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品，是當(dāng)今分子生物學(xué)和生命科學(xué)重要的分析儀器之一。共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察諸多生理信號機(jī)細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。
共聚焦顯微鏡樣品制備是檢測前的關(guān)鍵步驟。樣品需經(jīng)熒光探劑標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo))。
標(biāo)本可以是固定的或活的組織，也可以是固定的或活的貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在Confocal專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上，懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片。樣品的Zda厚度約1~2mm，使用的蓋玻片厚度應(yīng)小于0.17mm，載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間，而且表面光潔，厚度均勻，沒有明顯的干擾熒光。固定樣品常用封片劑進(jìn)行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
常規(guī)樣品制備要求：
1、染料的選擇
由于共聚焦顯微鏡是以單一波長的激光作為光源，因此在選擇熒光染料時要根據(jù)共聚焦顯微鏡配備的激光器波長選擇，如果在同一樣品中有多種熒光染料標(biāo)記，還要考慮它們的發(fā)射波長盡量不要重疊，避免串色問題。
2、樣品承載物的選擇
一般的共聚焦顯微鏡高倍物鏡均為油鏡，它的數(shù)值孔徑較小，要求鏡頭與樣品之間的工作距離不大于0.17mm，因此如果觀察樣品為貼壁細(xì)胞或組織切片，可以用普通的載玻片和蓋玻片即可。如果是懸浮細(xì)胞或懸浮粒子，可以用共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿承載樣品進(jìn)行觀察。
3、封片劑的選擇
如果樣品只需要觀測一次并且不是極易淬滅的熒光，可以選用一定濃度的甘油混合液封片即可。如果樣品需要放置一段時間并多次拍攝，應(yīng)選用抗熒光淬滅的封片劑，以減少熒光信號丟失。
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