腺苷脫氨酶(ADA)檢測試劑盒(波氏微板法)

      腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase，ADA)是嘌呤核苷代謝中重要的酶類，屬于一種巰基酶，每分子至少含 2 個活性巰基，ADA 能催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷，再經(jīng)核苷磷酸化酶作用生成次黃嘌呤，其代謝緩和終產(chǎn)物為尿酸，廣泛分布于人體各組織中，以    胸腺、脾和其他淋巴組織中含量高，而肝、肺、腎和骨胳肌等含量低。

      腺苷脫氨酶(ADA)檢測試劑盒(波氏比色法)其檢測原理是待測樣品中的 ADA 催化腺嘌呤核苷水解脫氨，產(chǎn)生次黃嘌呤核苷和銨離子，利用波氏顯色法測定氨離子生成量，    其反應(yīng)公式為：腺苷+H₂O→次黃嘌呤+NH₃，通過分光光度法(酶標(biāo)儀)測定 640nm 處吸光度，根據(jù)計算公式可得 ADA 活力，100T 試劑盒可測 50~55 個樣品。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

 產(chǎn)品組成：

自備材料：

1、離心管或小試管

2、水浴鍋

3、96 孔板

4、酶標(biāo)儀

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品：

①血漿、血清樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備，可以直接用于本試劑盒的測定，-20℃    凍存，用于 ADA 的測定。

②細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行勻漿，低速離心取上清，-20℃凍存，用于 ADA

的測定。

③高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的 ADA，可以使用 ddH₂O 稀釋。

④(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的 ADA 含量。

2、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：用 ddH₂O 準(zhǔn)確稀釋氨氮標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)至 25μg/ml，即為氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

3、ADA 加樣：按照下表設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、對照孔、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的酶活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后    再進(jìn)行測定。

4、ADA 測定：以 ddH₂O 調(diào)零，酶標(biāo)儀 640nm 處測定吸光度(分別為 A_空白、A_對照、A_標(biāo)

_{準(zhǔn)、A測定})。

計算：

ADA 活性單位的定義：在 37℃ 1ml 血清中 ADA 1h 催化底物產(chǎn)生 1μg 氨氮為一個ADA 酶活力單位。

血清、血漿中 ADA 活力(U/L)=(A_測定-A_對照)/(A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白)×25

組織中 ADA 活力(U/mg)=[(A_測定-A_對照)/(A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白)×25]/待測樣品的蛋白濃度(mg/ml) 式中：

A_測定=測定孔的吸光度

A_對照=對照孔的吸光度

A_{標(biāo)準(zhǔn)}=標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度

A_空白=空白孔的吸光度

注意事項(xiàng)： 

1、 稀釋樣品和研磨樣品所用水，均應(yīng)為 ddH₂O，不可為普通的水。

2、 如果采用單位，需在測得活力單位基礎(chǔ)上乘以 1.19。

3、 如果沒有酶標(biāo)儀，也可用分光光度計測定，但應(yīng)注意加入試劑量不同，相應(yīng)的檢測次數(shù)會大大減少。

4、 采用分光光度計未調(diào)零情況下，Leagene 空白參考范圍在 0.05~0.09 之間，25μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)參考范圍在 0.13~0.18 之間，由于儀器設(shè)備、操作方法以及工作環(huán)境不同，參考范圍會有差異。

5、 該試劑盒測定下限在 2~5μg/ml 之間，測定上限在 70~90μg/ml 之間；從肉眼觀察， 一般情況下濃度在 15~30μg/ml 即可顯淡藍(lán)色；濃度≤15μg/ml 可顯淡黃色；濃度

≥30μg/ml 可顯藍(lán)色，一般情況下接近上限比接近下限更準(zhǔn)確。

6、 胸水標(biāo)本經(jīng)離心后取上清，置于 4℃保存?zhèn)溆?，ADA 活性可穩(wěn)定 1 周。

7、 血清樣本應(yīng)避免溶血，4℃保存 3 天。

有效期：6 個月有效。4℃運(yùn)輸，4℃保存。