免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）

一、實驗原理

以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎的用于研究（蛋白質相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質在完整（細胞內生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。

CO-IP應用與IP區(qū)別

1、測定兩種目標蛋白質是否在體內結合

2、確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔

CO-IP與IP只取決于檢測焦點是初級靶分子（抗原）還是次級靶分子（相互作用蛋白）

二、實驗過程

1、提取蛋白。

2、在細胞裂解液中加入抗X的抗體。

3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質上)。

若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成復合物：“Y—X—抗X抗體—Protein A或G"

4、經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。（xy抗原、x抗體）。

5、western blot分析，質譜分析。

（Protein A是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結合。）

ProteinA/G的作用及原理

“捕獲”抗體，形成復合物，

抗體-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共價健結合

ProteinA/G- beads 共價結合

三、CO-IP特征

優(yōu)點：

1、相互作用的蛋白質都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。

2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響。

3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。

局限性：

1、可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用

2、兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，有第三者在中間起橋梁作用；

3、必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇后檢測的抗體，若預測不正確，實驗就得不到結果

四、實驗的關鍵

1、實驗需要注意點就是抗體的性質。特別是多抗的特異性是問題。

2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗。

3、考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。

4、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。

五、注意的問題：

1、裂解液

(1)、細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。

(2)、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktail

2、免疫沉淀中抗體的選擇

3、抗體

使用對照抗體：（陰性和陽性）

陰性：單克隆抗體：同一種屬的IgG

兔多克隆抗體：正常兔IgG

陽性：細胞內某種蛋白的抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）

六、未檢測到目得蛋白或蛋白很少

可能原因

1、樣品被蛋白酶降解：

添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融

2、抗體濃度太低：

調整抗體濃度，必要時設立濃度梯度，摸索較佳濃度

3、抗抗體親合力太低：

選用適合于IP和/或IB的相應抗體

4、IP抗體未與珠子結合：

選用適合于IP的相應珠子，正確保存防止變質或干燥

5、Tag未暴露在融合蛋白構象的表面：

改變tag融合表達部位

6、裂解液嚴謹度太高：

改用低嚴謹度裂解液

七、目得蛋白高背景

可能原因

1、非特異蛋白結合：

（1）在無血清培養(yǎng)液中裂解細胞；

（2）在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預洗，

（3）免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴謹度（高鹽或去垢劑）

2、裂解液嚴謹度太低：

改用高嚴謹度裂解液。

3、實驗儀器或液體被污染：

使用潔凈的儀器或液體。

4、轉移膜上的非特異吸附：

戴手套，用鑷子夾取，不要接觸膜轉移面。