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創(chuàng)凌生物淺析免疫共沉淀Co-IP

來源:上海創(chuàng)凌生物科技有限公司   2020年09月16日 08:27  

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)

一、實驗原理

以(抗體和抗原)之間的專一性作用為基礎的用于研究(蛋白質(zhì)相互作用)的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整(細胞內(nèi)生理性)相互作用的有效方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

 

CO-IP應用與IP區(qū)別

1、測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結合

2、確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔

CO-IP與IP只取決于檢測焦點是初級靶分子(抗原)還是次級靶分子(相互作用蛋白)

 

二、實驗過程

1、提取蛋白。

2、在細胞裂解液中加入抗X的抗體。

3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質(zhì)上)。

若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白,就可以形成復合物:“Y—X—抗X抗體—Protein A或G"

4、經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳,復合物又被分開。(xy抗原、x抗體)。

5、western blot分析,質(zhì)譜分析。

(Protein A是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質(zhì),能特異性地與人和哺乳動物抗體(主要是IgG)的Fc區(qū)結合。)

ProteinA/G的作用及原理

“捕獲”抗體,形成復合物,

抗體-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共價健結合

ProteinA/G- beads 共價結合

 

三、CO-IP特征

優(yōu)點:

1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài)。

2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的,可以避免人為的影響。

3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。

 

局限性:

1、可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

2、兩種蛋白質(zhì)的結合可能不是直接結合,有第三者在中間起橋梁作用;

3、必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇后檢測的抗體,若預測不正確,實驗就得不到結果

四、實驗的關鍵

1、實驗需要注意點就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問題。

2、為防止蛋白的分解、修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑,低溫下進行實驗。

3、考慮抗體/緩沖液的比例??贵w過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋。

4、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的,這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。

五、注意的問題:

1、裂解液

(1)、細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經(jīng)驗確定。

(2)、不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktail

2、免疫沉淀中抗體的選擇

3、抗體

使用對照抗體:(陰性和陽性)

陰性:單克隆抗體:同一種屬的IgG

兔多克隆抗體:正常兔IgG

陽性:細胞內(nèi)某種蛋白的抗體(做膜蛋白A,用膜蛋白B)

 

六、未檢測到目得蛋白或蛋白很少

可能原因

1、樣品被蛋白酶降解:

添加蛋白酶抑制劑;所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融

2、抗體濃度太低:

調(diào)整抗體濃度,必要時設立濃度梯度,摸索佳濃度

3、抗抗體親合力太低:

選用適合于IP和/或IB的相應抗體

4、IP抗體未與珠子結合:

選用適合于IP的相應珠子,正確保存防止變質(zhì)或干燥

5、Tag未暴露在融合蛋白構象的表面:

改變tag融合表達部位

6、裂解液嚴謹度太高:

改用低嚴謹度裂解液

 

七、目得蛋白高背景

可能原因

1、非特異蛋白結合:

(1)在無血清培養(yǎng)液中裂解細胞;

(2)在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預洗,

(3)免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴謹度(高鹽或去垢劑)

2、裂解液嚴謹度太低:

改用高嚴謹度裂解液。

3、實驗儀器或液體被污染:

使用潔凈的儀器或液體。

4、轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附:

戴手套,用鑷子夾取,不要接觸膜轉(zhuǎn)移面。

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