血液活化凝血因子X（FACTOR Xa）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

  血液活化凝血因子X（FACTOR Xa）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽化合物底物Benzoyl-Ile-Glu-（γ-OR）-Gly-Arg-pNA，在凝血因子X激活酶存在與否的情況下，受到活化凝血因子X的水解，釋放黃色對硝基苯胺，產(chǎn)生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定血液樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種血漿樣品（動物、人體等）活化凝血因子X（FACTOR Xa）的活性檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

凝血因子X（FACTOR X；FX；EC3.4.21.6），又稱為斯圖亞特因子（Stuart-Prower Factor）或凝血酶原酶（prothrombinase），是一種絲氨酸內(nèi)肽酶（serine endopeptidase）， 存在于血液循環(huán)中的凝血蛋白，由45Kd重鏈和17Kd輕鏈組成，是凝血瀑布反應(yīng)中的主要酶之一，即凝血酶（thrombin）通路的個成員。凝血因子X在維生素K的參與下，在肝臟合成，半衰期為40至45小時。凝血因子X通過凝血因子IX-凝血因子VIII復(fù)合體（內(nèi)在性因子X酶；intrinsic Xase）和凝血因子VII-組織因子復(fù)合體（外在性因子X酶；extrinsic Xase）激活為活化因子X（FACTOR Xa；FXa）。同時可以被魯塞爾蝰蛇毒X（Russell viper venom；RVV-X）和胰蛋白酶（trypsin）激活。受到蛋白Z依賴性蛋白酶抑制劑（protein Z-dependent protease inhibitor；ZPI）抑制。其功能在于切離凝血因子II，產(chǎn)生活化因子II，即凝血酶（thrombin）。凝血因子X缺陷將導(dǎo)致鼻出血（epistaxis）、關(guān)節(jié)血腫（hemarthrosis）、胃腸道失血、淀粉樣變性（amyloidosis）等。此外活化凝血因子X抑制劑用于抗凝血治療，包括肝素（heperin）。凝血酶的目標(biāo)蛋白切離部位為Arg-Thr和Arg-Ile。基于人工合成的多肽化合物底物Benzoyl-Ile-Glu-（γ-OR）-Gly-Arg-pNA（苯酰-異亮氨酰-谷氨酰-γ- OR-甘氨酰-精氨酰對硝基苯胺），在凝血因子X激活酶魯塞爾蝰蛇毒X（Russel Viper Venom X；RVV-X）存在與否的情況下，受到活化因子X的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定活化凝血因子X的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

  緩沖液（Reagent A） 毫升

  陰性液（Reagent B）   毫升

  底物液（Reagent C）   微升

  活化液（Reagent D） 微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent C）避免光照和反復(fù)凍融；  活化液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板或比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

• 樣品制備

• 準(zhǔn)備好ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA和肝素抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
• 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。  緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 活化因子X（FXa）測定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中
• 分別加入xx微升  陰性液（Reagent B）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 分別加入xx微升  底物液（Reagent C）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
• 即刻放進酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 活性計算：

• 酶標(biāo)儀檢測

• 比色皿檢測

• 凝血因子X（FX）測定

檢測開始前，移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升  活化液（Reagent D）和待測樣品（注意：50微克蛋白），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育5分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到所有孔里
• 加入xx微升  陰性液（Reagent B）到背景對照孔里
• 加入20微升上述制備的待測樣品到樣品孔里
• 分別加入xx微升  底物液（Reagent C）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
• 即刻放進酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 活性計算：

• 酶標(biāo)儀檢測

• 比色皿檢測

注意事項

• 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照
•   活化液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)60分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定60分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 樣品中含有500微摩爾以下總膽紅素（bilirubin）、300微摩爾以下血紅蛋白（hemoglobin）不會干擾檢測
• 活化因子X單位活性定義為：在37℃，pH 8..6條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾多肽化合物底物Benzoyl-Ile-Glu-（γ-OR）-Gly-Arg-pNA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞蛋白酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感