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聯碩生物:細胞培養(yǎng)

來源:浙江聯碩生物科技有限公司   2020年09月18日 13:13  

什么是細胞培養(yǎng)?

有哪三種細胞培養(yǎng)?

細胞培養(yǎng)的條件是什么?

細胞培養(yǎng)的具體步驟是什么?

 

定義:細胞培養(yǎng)(cell culture)是指在體外模擬體內環(huán)境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等),使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術,在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術。不論對于整個生物工程技術,還是其中之一的生物克隆技術來說,細胞培養(yǎng)都是一個*的過程,細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)模克隆。細胞培養(yǎng)技術可以由一個細胞經過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞,這是克隆技術*的環(huán)節(jié),而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。細胞培養(yǎng)技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術,通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞,又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

 

細胞培養(yǎng)的分類:動物細胞培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)、微生物細胞培養(yǎng)

 

細胞培養(yǎng)的條件:

1.培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)基包含細胞生長所需的各種營養(yǎng)物質,包括碳水化合物、氨基酸、無機鹽、維生素等。針對不同細胞的營養(yǎng)需求,有多種合成培養(yǎng)基可供選擇,如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。

2.其他添加成分

在各種合成培養(yǎng)基提供基礎營養(yǎng)物質之外,還需根據不同細胞和不同的培養(yǎng)目的添加其他成分,如血清、因子等。

血清提供的是細胞外基質、生長因子和轉鐵蛋白等重要物質,常用的是胎牛血清。要根據不同的細胞和不同的研究目的決定添加血清的比例。10%~20%的血清能維持細胞較快的生長增殖速度,稱為生長培養(yǎng)液;為維持細胞緩慢生長或不死,添加2%~5%的血清即可,稱為維持培養(yǎng)液。但血清中也存在有害于細胞生長和繁殖的物質,如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子;成分不明確,影響對結果的分析;不同動物、不同批次的血清活性差別較大,影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。

谷氨酰胺是細胞生長重要的氮源,在細胞生長代謝過程中起重要作用,但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解,4℃下放置7天即可分解約50%,故谷氨酰胺需在使用前添加。

 

細胞培養(yǎng)的具體步驟:

一、細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移入15ml離心管中,加入10ml預熱的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時.去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放入細胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10ml PBS(經高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進行計數,按照1×105/盤接種,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%~90%時,去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放入細胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。加入1ml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(盒內有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內,過夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放入液氮,可以保存三個月。

凍存液的配制:70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。

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