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1、前沿：粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是腫瘤病人化療后提升白細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)療法，其 中重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化療 和放療引起的白細(xì)胞數(shù)減少癥[1]。成熟的內(nèi)源性人粒細(xì)胞集落刺 激因子（G-CSF)由174個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為18-20kDa。 利 用基因工程技術(shù)，Amgen公司在1991年上市了大腸桿菌發(fā)酵的 短效版G-CSF非格司亭（Neupogen），2001年上市了長效版 G-CSF培非格司亭（Peglgrastim，Neulasta）。Neupogen和 Neulasta兩者的區(qū)別在于長效版使用了PEG的修飾技術(shù)，使CSF 的分子量和體積變大，延長了半衰期，從而把化療周期內(nèi)的注 射次數(shù)從7-10次減少到1次注射，增加了臨床使用的便利[2]

PEG修飾使蛋白相鄰電荷態(tài)之間疊加非常嚴(yán)重[3,4]，為了降低蛋 白電荷數(shù)，需要在色譜流動(dòng)相中使用三氟yi酸（TFA），取代 常用的甲酸（FA），使樣品m/z向高質(zhì)量端移動(dòng)，從而減少相 鄰電荷態(tài)之間的信號(hào)疊加；在質(zhì)譜中PEG修飾的蛋白會(huì)發(fā)生去 PEG化，為了避免此種情況，要在柱后添加三乙基胺（TEA） ；TEA同時(shí)也可以起到降低蛋白電荷態(tài)的作用[5]。

 實(shí)驗(yàn)方法 儀器及試劑 • Thermo™ Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer • Thermo™ Ulimate3000 3400RS UHPLC system • Thermo Scientic™ Hypersil GOLD™ C18 column, 1.5 μm, 2.1 × 150 mm• Thermo Scientic™ Acetonitrile, UHPLC-MS grade Thermo Scientic™ Pierce™ Triuoroacetic Acid, Sequencing grade Sigma-Aldrich Triethylamine, ≥99%

 實(shí)驗(yàn)樣品 總共兩個(gè)PEG-rhG-CSF類樣品，一個(gè)是原研藥Neulasta，另一 個(gè)是仿制藥Biosimilar。樣品均為無色澄清溶液。 樣品前處理步驟 以Millipore Water將兩個(gè)樣品分別稀釋至1mg/mL后上LC-MS平 臺(tái)分析，測定其完整分子量。

 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置 液相色譜實(shí)驗(yàn)條件： 流動(dòng)相：A(50%ACN+0.1%TFA), B(95%ACN+0.1%TFA) ； 柱溫：50℃； 流速：0.3mL/min; Postcolumn-addition: 400mM TEA in water, 5μL/min; 上樣量：1μg. 色譜梯度如表1所示；為減少TEA及TFA對質(zhì)譜系統(tǒng)的污 染，3min之后的組分均通過質(zhì)譜自帶六通閥切入廢液。

 數(shù)據(jù)處理軟件 使用Thermo Scientic BioPharma Finder 3.2軟件進(jìn)行完整分子 量分析，實(shí)驗(yàn)參數(shù)如圖1所示。

 圖3展示了Neulasta樣品在分辨率15000/120000下的解卷積 結(jié)果。分辨率=15000時(shí)，總共檢測到181個(gè)組分。由圖中可 見，隨分辨率增高，相鄰組分之間得到更好分離；當(dāng)分辨率為 15000時(shí)，對于nPEG=483的組分，其理論與實(shí)測分子量偏差 為-2.26Da；當(dāng)分辨率為120000時(shí)，對于nPEG=483的組分， 其理論與實(shí)測分子量偏差為0.35Da。可見隨著分辨率的增高， 可將分子量相近的組分分離開（上右圖中紅線與藍(lán)線所示的兩 個(gè)組分），從而提高分子量測定的準(zhǔn)確度。

 同樣由于PEG修飾，導(dǎo)致樣品高度復(fù)雜。對其進(jìn)行解卷積處理 （圖5），在15000分辨率下共檢測到141個(gè)組分，同樣呈正態(tài) 分布，選取局部區(qū)域放大觀察，各個(gè)組分之間均實(shí)現(xiàn)了基線分 離（局部放大圖）

 使用BioPharma Finder軟件對原研藥和類似藥進(jìn)行鏡像圖對 比，可見相比于原研藥，生物類似藥的分布整體向高質(zhì)量端 平移，說明修飾的PEG鏈分布不同。根據(jù)前述公式分別計(jì)算兩 個(gè)樣品的Mn，Mm和PD，結(jié)果如表3所示。由表3中可以明顯 看出，由于修飾PEG鏈的分布不同，導(dǎo)致原研藥和類似藥的 Mn ，Mm和PD均有差異。

 結(jié)論 ：在本文的研究中，我們在賽默飛Q Exactive HF-X平臺(tái)上對PEG修飾的 Neulasta及其生物類似藥分子量進(jìn)行了測定，并計(jì)算了其數(shù)均 分子量、質(zhì)均分子量和PEG多分散性，以評估類似藥與原研藥 的相似程度。從結(jié)果中可以看出，相比于原研藥，生物類似藥 的分子量整體向高質(zhì)量端平移，表明PEG修飾鏈的分布有所差 異；得益于Orbitrap高分辨質(zhì)譜平臺(tái)的優(yōu)異性能，對于高度復(fù)雜 的PEG修飾樣品，仍然能夠?qū)崿F(xiàn)相鄰質(zhì)譜峰間的基線分離，從 而準(zhǔn)確測得其分子量用以評估PEG修飾鏈的分布，從而對產(chǎn)品 進(jìn)行評估。

參考文獻(xiàn) 1 Lyman GH, Dale DC, Culakova E, Poniewierski MS, Wolff DA, Kuderer NM, Huang M, Crawford J. Annals of Oncology. 24 (10): 2475–84. 2 Harris, J. M.; Chess, R. B. Nat. Rev. Drug Discovery 2003, 2, 214−21. 3 Mann, M.; Meng, C. K.; Fenn, J. B. Anal. Chem. 1989, 61, 1702−1708. 4 Trimpin, S.; Plasencia, M.; Isailovic, D.; Clemmer, D. E. Anal. Chem. 2007, 79, 7965−74. 5 Huang, L. H.; Gough, P. C.; DeFelippis, M. R. Anal. Chem. 2009, 81, 567−577.