干貨分享|qPCR復孔平臺期熒光信號不同會影響實驗結(jié)果嗎？

王老師：您好，近用你們的試劑跑qPCR，復孔平臺期的熒光信號不同，這樣的結(jié)果能用嗎？

小翊：您好，老師。從圖中來看，復孔重復性是比較好的，△Ct值<0.5, 這個結(jié)果沒什么問題的。

王老師：那為什么復孔的平臺期信號還有相差呢？有什么方法可以使復孔熒光信號一致嗎？

近有不少客戶咨詢小翊類似的問題，擔心這樣的數(shù)據(jù)不可靠今天小翊就幫您解除疑慮！

復孔平臺期不同不會影響實驗結(jié)果（△Ct<0.5）

*，理想的PCR擴增是使DNA分子由1變2，2變4，以2ⁿ進行擴增的。但實際上，隨著循環(huán)數(shù)的增加，體系中的Taq酶、dNTP、引物等逐漸被消耗并伴隨著副產(chǎn)物的生成，使得PCR不能呈指數(shù)擴增，從而使實際的擴增曲線呈現(xiàn)“S”型，通常分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期三個階段，如圖1。

基線期是指PCR開始的3-15個循環(huán)時期，這段時期擴增是存在的，但因循環(huán)次數(shù)較少，體系中雙鏈DNA積累較少，熒光信號強度沒有超過熒光本底信號，此時的熒光值對于機器來說很難準確檢測。指數(shù)擴增期是指PCR產(chǎn)物的量增長//快的一個時期，理想條件下，是呈指數(shù)增長的，在這個時期由于樣品間的細小誤差尚未放大，所以復孔的熒光信號在這個時期相對一致。通常熒光閾值需要設置在此時期，熒光信號達到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱之為Ct值，故各復孔間的Ct值有較好的重復性（△Ct＜0.5）。而平臺期是指由于原料耗盡、反應副產(chǎn)物的產(chǎn)生等原因使得擴增變得緩慢的一個時期。此時期經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)較多，使樣品間的細小差異被無限放大，從而導致復孔間平臺期的熒光信號相差很大。

圖1 擴增曲線的三個階段

下面為大家展示一個案例，以293T-cDNA的20倍稀釋液為模板，擴增GAPDH基因，90個復孔（如圖2）。

圖2 同一樣品的90個重復的擴增曲線圖

由圖可以看出該實驗的復孔重復性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE標準。但平臺期的熒光信號值均有差異。

綜上：數(shù)據(jù)的有效性和復孔平臺期熒光信號關系不大，主要與復孔間的△Ct有關，MIQE標準是△Ct＜0.5。

在復孔△Ct<0.5的情況下，復孔平臺期不同并不影響實驗結(jié)果，但是有沒有辦法可以讓復孔平臺期熒光信號盡量一致呢？

使復孔平臺期熒光信號趨于一致的秘訣

1、確保加樣的準確性

1）qPCR各組分*化凍需要混勻。

2）采用預混的方式進行加樣，保證體系的均一性?？梢詫?/span>除模板以外的試劑進行預混，分注至各管中。

3）模板濃度高時，可將模板稀釋，提高加樣體積，減少加樣誤差。

2、確保移液的精///準度

加樣過程需確保移液槍未出現(xiàn)漏氣、漏液的情況，避免使用精///準度差的移液槍或者不配套的槍頭。

3、體系混勻并進行離心

體系加完后要用移液槍吹打并進行離心，以防試劑掛壁或者體系中有氣泡造成實驗結(jié)果不準確。

4、qPCR試劑的選擇：選擇“預混液”形式的qPCR試劑，反應體系只需加入引物和模板，大大簡化實驗的操作步驟，減少了加樣誤差。

好了，讀到這里，您應該不會再用糾結(jié)復孔平臺期熒光信號不同的事了吧？為了簡化您的qPCR實驗操作，讓您的qPCR數(shù)據(jù)更完美，小翊為您推薦一款SYBR Green預混液：Hieff UNICON^® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat 11184ES），該產(chǎn)品是預混液形式的qPCR試劑，另外適合于所有的qPCR儀器平臺（如圖3），兼容快速程序，可以大大簡化您的實驗操作并能保證您實驗結(jié)果準確性。

圖3. 適合于所有的qPCR儀器平臺