賽默飛與合作實驗室成功開發(fā)標準化HRMS1-DIA方法

關注我們，更多干貨和驚喜好禮癌癥Moonshot計劃啟動后，出現了許多精準醫(yī)學項目，該計劃旨在通過改善早期發(fā)現，患者分類以及監(jiān)測治療效果和復發(fā)來增強癌癥患者的管理，從而加速癌癥研究。有關蛋白質型的信息，定義為蛋白質組的實際狀態(tài)，其數量，時間和空間的表達以及與基因型的相關性（所謂的蛋白質組學），將大大增加我們對包括癌癥在內的各種人類疾病的理解。在這一過程中，迫切需要一種質譜分析策略，以提供可靠且可重現的定量數據。

Orbitrap已經成為蛋白質組學實驗室的金標準，賽默飛高級產品經理軒玥博士聯(lián)合多個實驗室瞄準數據非依賴性質譜采集（Data-independent acquisition，DIA）的非標記定量蛋白質組方法，用于支持精準醫(yī)學的高通量臨床蛋白質組學分析。作者首先建立了高通量、簡化的HRMS1-DIA工作流程，該工作流程在隨后的11個實驗室中連續(xù)7天測試和集中的數據處理；開發(fā)了一種質量控制（QC）系統(tǒng)，以監(jiān)視整個工作流程的性能，即時發(fā)現儀器性能的變化，并在必要時指導故障排除，確保維持較高水平的數據質量，以實現大型臨床隊列研究所需的通量；在整個研究過程中，每個實驗室都使用一套完善的非標記定量樣品對定量性能進行評估，從而可以進行分布式和縱向數據分析，并可以在大數據分析時進行比較和標準化。

簡化的HRMS1-DIA工作流程進行數據采集和分析

?鑒定QC:

PierceTM Hela Protein Digest Standard

?定量QC:

Sample A(20%E.coli,15%Yeast和65%Hela),

Sample B(4%E.coli,30%Yeast和65%Hela)

?色譜條件:

ES806(Acclaim PepMap RSLC C18, 2 µm,100 Å,150 µm i.d. × 150 mm),

60min色譜梯度，流速1.2µL/min

?質譜:QEHF

?DIA數據采集方法:

HRMS1-DIA，1個cycle包括3個R120K MS1掃描，每個MS1掃描之間穿插18個15 Da 隔離窗口的R30K DIA MS / MS掃描（總共54個DIA MS/MS掃描）。高分辨的一級用于定量分析，二級用于肽段鑒定。此處采用的HRMS1-DIA方法中，MS1掃描周期速率（1.7s）與MS2循環(huán)時間無關，可確保有足夠數量MS1掃描的數量保證定量的重現性。相比之下，MS2采集時設置相對較窄15Da的隔離窗口，能夠大限度的提高肽檢測效率。

?數據分析:

11個實驗室的數據統(tǒng)一上傳至Thermo Cloud云平臺，SpectronautTM軟件提取DIA色譜峰。

HRMS1-DIA實驗流程（點擊查看大圖）

鑒定QC質控標準

每個實驗室根據鑒定QC進行系統(tǒng)質控，作者提出了多個質控的指標，蛋白質組學實驗室可以作為參考，包括色譜的峰寬、MS1和MS2采集的點數、Precursor和蛋白數目以及定量的CV。只有符合QC相應的指標才能繼續(xù)實驗。如果不滿足條件，需要排查是色譜問題還是質譜問題。

定量QC的質控

定量QC的目的是考察HRMS1-DIA定量流程的準確性，SampleA/B中Hela的理論比例是1:1，Yeast是1:2，E.coli是4:1。作者提出了兩種方法對定量QC進行質控：

（1）定量真實比值與理論比值的偏差，不超過25%；

（2）定量的重現性，CV小于25%。

HRMS1-DIA的重現性

Sample A和Sample B在11個實驗室進行7天的數據采集，一共產生了240個DIA數據，共鑒定超過7600個蛋白，其中4000個人蛋白，2000個酵母蛋白以及400個E.coli蛋白。首先看單個實驗室7天內定量的重現性，平均每個實驗室每天均可以分別定量超過6500個蛋白；然后看實驗室間的重現性，5784個蛋白被每個實驗室定量到，4564個蛋白被每個實驗室每天定量到。

HRMS1-DIA定量的重現性。（a）每個實驗室平均定量到的蛋白，共定量的蛋白，共同定量到的蛋白數目和百分比；（b）各個實驗室組合中共同定量的蛋白質數量。（點擊查看大圖）

如何獲取HRMS1-DIA方法？

點擊文末左下角閱讀原文，可查看本實驗HRMS1-DIA全部的方法，包括色譜、質譜和數據分析方法，有興趣的老師可以查閱。文章中使用的液相色譜、液相色譜柱等備件我們已經做成了相應的貨號，可以和當地銷售聯(lián)系。

詳細HRMS1-DIA方法

HRMS1-DIA工作流助力精準醫(yī)學轉化研究（上）

HRMS1-DIA工作流助力精準醫(yī)學轉化研究（下）

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