兔黏液瘤病毒(RMV)核酸檢測試應液的配制:
PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣,在后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,要求在反應液上覆蓋一層礦物油,防止水分蒸發(fā)。
對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時,有時會擴增不出產(chǎn)物。在遇到這個問題時,如果將反應成分分開配制,A管含模板、引物和dNTP,以及調(diào)整體積的H2O,B管含緩沖液、DNA聚合酶和水,然后再將兩管溶液混合起來,可較好地克服這個問題。
按照常規(guī)的方法配制反應體系,有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動(hotstart)PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液,Mg2+和primer先配制好,然后加入一粒蠟珠(如AmpliWaxPCRQam100),加熱熔化,再冷卻,使蠟將溶液封住,后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后,蠟層熔化,所有反應成分才會混合在一起。
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