省時省力, 二維液相分析配方奶粉中的維生素A D E

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配方乳——脂溶性維生素

維生素是人和動物為維持正常的生理功能而必須從食物中獲得的一種微量有機(jī)物質(zhì)，根據(jù)物理性質(zhì)不同分為水溶性和脂溶性兩大類，其中脂溶性維生素A、D、E在人體的視覺能力、免疫功能、抗氧化抗衰老能力等諸方面都有著重要的生理功能。維生素不足會造成人體的亞健康，因此對于維生素的補(bǔ)充越來越受到人們的重視。嬰幼兒及成人配方乳品是脂溶性維生素強(qiáng)化的重要形式之一。

配方奶粉基質(zhì)復(fù)雜，我國和歐洲的關(guān)于食品中維生素 D 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法中，需采用正相制備色譜、反相分析色譜兩套儀器，分別進(jìn)行凈化制備和分析，分析效率很低。

賽默飛很早提出了二維液相的解決方案，采用一套液相兩根色譜柱中心切割的方法可以將維生素A、D、E異構(gòu)體*分離，方案被伊利、君樂寶等諸多乳品企業(yè)所采用。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，介紹更省時的超快速在線二維方案和既省時又省力的在線固相萃取-二維液相方案。

超快速在線二維方案

本方案儀器配置如下

儀器：Thermo Fisher Vanquish高效液相色譜儀

泵：Vanquish Dual Pump（VF-P32-A-01）

自動進(jìn)樣器：Vanquish Autosampler (VF-A10-A, 100 μL Sample Loop）

柱溫箱：Vanquish Column Compartment（VH-C10-A, 含兩個Viper Only 2p-6p切換閥）

檢測器：Vanquish Diode Array Detector HL（含10mm或60mm光纖池）

樣品收集環(huán)體積：500 μL

色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3

儀器連接圖見圖2。

圖2  儀器連接圖（超快速在線二維方案）

（點(diǎn)擊查看大圖）

供試品溶液制備

參考GB 5009.82-2016的方法，精密稱取固體奶粉試樣約10 g（精確到0.01 g）于150 mL平底燒瓶中，用約30 mL 45 ℃～50 ℃溫水使其溶解，混勻。于上述處理的試樣溶液中加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻，加入30 mL無水乙醇，充分混勻后加入約20 mL 0.5 g/g的氫氧化鉀水溶液混勻，在80 ℃恒溫水浴振蕩皂化約30 min后，取出立刻用冷水冷卻到室溫。

將上述皂化液轉(zhuǎn)移入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙醚混合液（1:1, V:V），振蕩萃取5 min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一個250 mL分液漏斗，加入50 mL石油醚-乙醚混合液再次萃取，合并醚液，用約100 mL水洗滌醚液，重復(fù)3次，至醚液洗至中性。醚液通過無水硫酸鈉脫水過濾，濾液收入250 mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在40 ℃水浴旋蒸至約2 mL，立即氮?dú)獯蹈?，用甲醇?fù)溶轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶后定容，上機(jī)分析。12min即可完成維生素A、D、E異構(gòu)體7個化合物的分析，測定譜圖見圖3。

圖3維生素A、D和E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分析譜圖（a：維生素A；b：維生素D2和D3；c：維生素E）

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在線固相萃取-二維液相方法

上面介紹的超高效液相平臺方案給大家節(jié)省了分析時間，下面這個方案可在賽默飛常規(guī)液相上運(yùn)行，結(jié)合在線固相萃取，可以實(shí)現(xiàn)皂化液直接上機(jī)分析，省時又省力。

樣品皂化過程同上，皂化后，取出立刻用冷水冷卻到室溫，用50%乙醇水溶液轉(zhuǎn)移并定容到100mL量瓶中。皂化液高速離心5～10min（>5000rpm）后用0.22μm尼龍材質(zhì)針式過濾器過濾后上機(jī)分析。

該方案儀器配置上采用三泵兩檢測器雙閥

實(shí)驗(yàn)所用儀器配置如下：

儀器：Thermo Fisher Vanquish高效液相色譜儀

泵：Vanquish Dual Pump（VF-P32-A-01）和Vanquish quatery Pump (VF-P20-A)

自動進(jìn)樣器：Vanquish Autosampler (VF-A10-A, 100 μL Sample Loop）

柱溫箱：Vanquish Column Compartment（VH-C10-A, 含兩個Viper Only 2p-6p切換閥

檢測器：Vanquish Diode Array Detector HL（含10mm或60mm光纖池），U3000 VWD3100 Detector（含11 μL流通池）

樣品收集環(huán)體積：500 μL

色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3

儀器連接圖見圖4，測定譜圖見圖5和圖6。

圖4  儀器連接圖（在線固相萃取-二維方案）

（點(diǎn)擊查看大圖）圖5. Vd測定譜圖（a為對照品，b為樣品）

圖6. Va和Ve測定譜圖（a為對照品，b為樣品）

（點(diǎn)擊查看大圖）

總結(jié)

賽默飛為大家提供了多種維生素A、D、E異構(gòu)體的測定方案，方案涵蓋常規(guī)液相和超高效液相、離線SPE和在線SPE，無論是對于現(xiàn)有儀器的升級改造還是全新平臺的建立都可以找到對應(yīng)的選擇?，F(xiàn)代化的儀器方法提高了奶粉樣品中脂溶性維生素的分析效率，減少了每日多批次樣品檢測任務(wù)的繁重。

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