l 本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關(guān)液體樣本中I型膠原(Col-I)的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

使用目的

本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關(guān)液體樣本中I型膠原(Col-I)的含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人I型膠原(Col-I)水平。用純化的人I型膠原(Col-I)抗

體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入I型膠原(Col-I)，再與HRP標(biāo)記的I型膠原(Col-I)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的I型膠原(Col-I)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人I型膠原(Col-I)濃度。

注意事項

l 本試劑盒僅用于科研，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

l 使用試劑盒，請仔細閱讀說明書，以試劑盒內(nèi)的說明書為準(zhǔn)，請務(wù)必理解說明書內(nèi)容。

l 酶標(biāo)包被板屬于可拆型，開封后如未用完，板條應(yīng)裝入鋁箔袋密封并2-8°C保存。

l 加樣樣本和試劑應(yīng)盡快完成。

l 避免實驗過程中酶標(biāo)板干燥；清洗后盡快加試劑。

l 實驗開始，所有試劑應(yīng)平衡到室溫  (21-26°C)  后方可進行。溫度會影響吸光度值，但不影響樣本值。

l 切忌用口加樣，以免試劑和樣本粘到皮膚和粘膜上。

l 不要在處理樣本或試劑的區(qū)域抽煙、吃東西、喝酒或化妝。

l 操作時帶次性手套，微生物的污染會影響實驗結(jié)果的正確性。

l 操作應(yīng)按照家規(guī)定的安全條列進行。

l 過期的試劑盒切勿再使用。

l TMB    底物對皮膚有刺激性，不慎ru眼，立即用大量水沖洗，皮膚上不慎接觸到也應(yīng)立即用肥皂， 并用大量的水沖洗。試驗中被污染的物品在下次使用應(yīng)盡快清洗。

試劑盒組成

9. 終止液6ml×1瓶

10. 酶標(biāo)試劑6ml×1瓶

11. 30倍濃縮洗滌液20ml×1瓶

需要而未提供的試劑和器材

l 吸光度值在450nm波長下檢測的酶標(biāo)儀。

l 1-2ml的加樣器。

l 100  ml和1L的量筒。

l 吸水紙。

l 37°C  恒溫箱。

l 蒸餾水或去離子水。

l 數(shù)據(jù)分析和繪圖軟件，圖紙。

l 標(biāo)準(zhǔn)和樣品稀釋的試管。

儲存條件

u 有效期內(nèi)的試劑如開封后未用完，請2-8°C  保存。

u 過期的試劑請不要用，打開后的試劑2-8°C  保存。

u 酶標(biāo)包被板必須2-8°C  保存，如有未用完的酶標(biāo)包被板，打開的鋁箔袋須密封并2-8°C  保存。

試劑準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

樣本處理及要求

1. 血清-用采血管收集血液，室溫血液自然凝固30分鐘，1000 xg離心15分鐘左右，收集上清，盡早

進行實驗，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存。

2. 血漿-收集好的血漿根據(jù)要求選擇EDTA或者檸檬酸鈉作為抗凝劑，2-8°C 1000 xg離心15分鐘左右，30分鐘內(nèi)收集好，-20°C 或 -80°C 保存，避免反復(fù)凍融。

3. 細胞上清及相關(guān)液體-收集好的樣本離心后應(yīng)盡快實驗，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存，避免反復(fù)凍融。

操作步驟

u 注意事項

l 所有試劑和樣本使用必須在室溫下平衡，混勻試劑時不應(yīng)起泡沫。

l 旦實驗開始，各操作步驟都應(yīng)盡快完成。

l 避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管，以免交叉污染。

l 般情況，酶的反應(yīng)與時間和溫度成正比。

u 操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備小試管 6 只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 100ul，然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品 100ul 加入只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取 100ul 加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取 100ul 加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取 100ul 加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取 100ul， 棄掉。第六只試管作為 0 號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后各管濃度分別是：4000pg/ml,2000pg/ml,1000pg/ml,500pg/ml,250pg/ml,0pg/ml,。

在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50ul（建議每個濃度做 2 個平行孔）。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品、酶標(biāo)試劑及生物素標(biāo)記的抗 Col-I 抗體，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品 40μl，然后再加生物素標(biāo)記的抗 Col-I 抗體 10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。

4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

5. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。

6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 后棄去，如此重復(fù) 5 次， 拍干。

7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 10 分鐘。

8. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后 15

分鐘以內(nèi)進行。

10. 檢測范圍：50pg/ml-4000pg/ml。

11. 靈敏度：≤10pg/ml。

實驗結(jié)果計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD      值代入方程式，計算出樣品濃度，即為樣品的實際濃度。