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激光共聚焦顯微鏡定位細(xì)胞熒光標(biāo)記的工作原理
激光共聚焦顯微鏡采用激光為激發(fā)光源，優(yōu)點(diǎn)是得到高的分辨率，記錄鈣離子三維空間分布；雙光子熒光顯微鏡則采用紅外激光作為光源，具有高空間分辨率，而且噪聲比較低。共聚焦顯微鏡可清晰地顯示相對(duì)較厚的(厚達(dá)幾百微米)標(biāo)本內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖像，尤其適于檢測(cè)熒光標(biāo)本。
使用傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡時(shí)，由于標(biāo)本全層的熒光團(tuán)都被光照到，而且它不僅收集焦平面上的熒光信號(hào)，還收集焦平面上下方的熒光信號(hào)，所以用它來觀察較厚熒光標(biāo)本時(shí)，圖像模糊且反差小。而激光共聚焦顯微鏡則選擇性收集來自標(biāo)本內(nèi)部相當(dāng)于單一焦平面的光切面(約lgm)的光線。
由于共聚焦顯微鏡基本沒有來自離焦區(qū)的光線，所以它所觀察的焦平面內(nèi)結(jié)構(gòu)要比傳統(tǒng)顯微鏡清晰得多。一系列不同厚度的光切面可使標(biāo)本的三維圖像得以重建。在檢測(cè)組織片或完整的小生物(如果蠅和斑馬魚的胚胎)中的熒光染色細(xì)胞時(shí)，可選用共聚焦顯微鏡。
共聚焦顯微鏡也可用來定位分離細(xì)胞內(nèi)的熒光標(biāo)記分子。由于其靈敏度較高，甚至可以用來監(jiān)控活體標(biāo)本內(nèi)的熒光，使得示蹤熒光探針如綠色熒光蛋白的利用成為可能。此外，有些型號(hào)的共聚焦顯微鏡加以調(diào)整后，可用于光漂白實(shí)驗(yàn)及光敏化“籠鎖”分子(紫外光照射前為失活狀態(tài))。
激光共聚焦顯微鏡通過聚焦光束掃描標(biāo)本及熒光信號(hào)的收集來實(shí)現(xiàn)光切，所收集的熒光信號(hào)為通過空間濾波器(-g-為針孔式)的所有光點(diǎn)，而空間濾波器是用來阻擋來自標(biāo)本離焦區(qū)域的信號(hào)的。
激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行光切的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。光源(常為激光器)均勻地照亮物鏡后焦平面，并將光線聚焦在標(biāo)本內(nèi)的衍射極點(diǎn)上。盡管焦平面上下方也能被照到，不過焦點(diǎn)照射強(qiáng)度大。由入射光激發(fā)的熒光分子向各個(gè)方向發(fā)出熒光。物鏡收集的熒光聚焦在像平面上，它與標(biāo)本內(nèi)的焦平面是共軛的(共焦的)。像平面內(nèi)的針孔孔徑允許標(biāo)本內(nèi)照明點(diǎn)發(fā)出的熒光通過并到達(dá)檢測(cè)儀，但卻阻止來自離焦區(qū)域的光線通過。
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