人單個核細胞分離液1.077是一種用于分離人外周血單個核細胞的無菌、低內毒素水平的密度梯度分離液。外周血中單個核細胞(PBMC)包括淋巴細胞和單核細胞,其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同,紅細胞和粒細胞密度較大,1.090g/mL 左右,淋巴細胞和單核細胞密度為 1.075~1.090g/mL,血小板為1.030~1.035g/mL。為此利用一種密度介于 1.075~1.092 之間而近于等滲的。
人單個核細胞分離液1.077使用說明:
1、取新鮮抗凝全血(EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可),用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。
2、在離心管中加入適量分離液(當稀釋后血液體積小于3mL時,加入3mL分離液;大于等于3mL,加入等體積分離液。但二者的總體積不能超過離心管的三分之二,否則會影響分離效果),將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方,注意保持兩液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取血液,然后將血液小心的平鋪于分離液上,因為兩者的密度差異,將形成明顯的分層界面。如果樣品較多加樣時間較長,在離心之前會出現(xiàn)紅細胞成團下沉屬正常現(xiàn)象。)
3、室溫,水平轉子500~1000g,離心20~30min(血液的體積越大所需的離心力越大,離心時間越長,分離條件需摸索,離心轉速大不超過1200g)。
4、離心后將出現(xiàn)明顯的分層:上層是稀釋的血漿層,中間是透明的分離液層,血漿與分離液之間的白膜層即為單個核細胞層,離心管底部是紅細胞與粒細胞。
5、小心的吸取白膜層細胞到15mL潔凈的離心管中,10mL PBS或細胞洗滌液洗滌白膜層細胞。250g,離心10min。
6、棄上清,5mL的PBS或細胞清洗液重懸細胞,250g,離心10min。
7、重復步驟6
8、棄上清,細胞重懸備用。
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