一步法快速WB（HRP）試劑盒（兔）說(shuō)明書(shū)

One Step Western Kit HRP (Rabbit)
目錄號(hào)：K2029
保存條件：2-8℃保存，避免冷凍。

組分說(shuō)明

Cat. No.                   K2029     K2029A        K2029B 
Kit Size                   10          2           50 
封閉液                     125 ml      3 0 m l     500 ml 
抗體反應(yīng)液     HRP（兔）   1 ml        2 0 0 μ l  5×1 ml 
抗體稀釋液                 125 ml      3 0 m l     500 ml 
漂洗液（10×）              125 ml      3 0m l     500 ml 

           本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途產(chǎn)品簡(jiǎn)介

一步法快速WB試劑盒（兔）是上海研謹(jǐn)生物xin推出的Western Blot檢測(cè)試劑盒，能夠在1小時(shí)左右得到高質(zhì)量的Western Blot結(jié)果，且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)。常規(guī)的Western Blot間接法檢測(cè)過(guò)程（封閉、一抗結(jié)合和二抗結(jié)合）需要較長(zhǎng)的時(shí)間，實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到載體膜上后，使用試劑盒中的封閉液孵育5 min，再用抗體反應(yīng)液處理后的一抗孵育載體膜，經(jīng)洗滌三次（每次5 min）后，即可進(jìn)行發(fā)光或顯色檢測(cè)。本試劑盒針對(duì)目的蛋白一抗為兔來(lái)源的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)使用。

注意事項(xiàng)

1. 客戶需自己準(zhǔn)備兔來(lái)源的一抗。
2. 使用封閉液、抗體稀釋液（兔）、漂洗液之前請(qǐng)充分混勻。
3. 漂洗液如在2-8℃保存時(shí)出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)恢復(fù)到室溫，把沉淀溶解后正常使用，1×漂
洗液可在室溫保存一個(gè)月。
4. 建議轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅等試劑染色，并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效
率。
5. 一抗和抗體反應(yīng)液HRP（兔）需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定jia的稀釋用量。
6. 抗體反應(yīng)液HRP（兔）、抗體稀釋液和抗體用量可根據(jù)膜的大小按比例放大或減少。
7. 加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復(fù)使用一次。特異性及親和力低的抗體不建議重
復(fù)使用?；厥蘸罂贵w如在1-2天內(nèi)使用放置在2-8℃，長(zhǎng)期保存請(qǐng)?jiān)?20℃凍存，避
免多次反復(fù)凍融。
8. 如果存在較高背景的情況，請(qǐng)調(diào)整抗體的用量，并增加洗膜次數(shù)。
9. 試劑盒內(nèi)所有試劑請(qǐng)于2-8℃保存，避免凍融。

操作步驟

本產(chǎn)品適用于轉(zhuǎn)膜完成后的封閉及抗體孵育步驟，以5 cm×8 cm 膜為例：
1．漂洗液準(zhǔn)備：取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml待用。每次洗膜用8-10 ml。
2．轉(zhuǎn)膜完成后，將膜浸沒(méi)到10 ml封閉液中，室溫封閉5分鐘。
3．倒掉封閉液，加入8-10 ml 1×漂洗液，于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。
4．洗膜的同時(shí)可準(zhǔn)備抗體孵育液：取抗體反應(yīng)液HRP（兔）100 μl到EP管中，加入兔
源一抗3-10 μg，槍頭吸打至充分混勻，室溫孵育5分鐘。
5．將混勻的抗體與反應(yīng)液HRP（兔）混合液加入到10 ml 抗體稀釋液中，充分混勻。

    注意：1）一抗的用量也可根據(jù)抗體的稀釋度來(lái)進(jìn)行調(diào)整。以抗體的終稀釋度1:1000為例，取100 µl抗體反應(yīng)液HRP（兔）到EP管中，加入10 µl一抗，加入到10 ml 抗體稀釋液中，充分混勻，室溫孵育5分鐘。

   2）如果膜面積較小，可按比例減少抗體、反應(yīng)液及稀釋液的用量。
6．步驟3中，洗膜完成后，倒掉漂洗液，將混合一抗、反應(yīng)液及稀釋液的抗體孵育液
加到膜上（確保孵育液*浸沒(méi)膜表面），在搖床上以60rpm左右的速度室溫孵育40分鐘。
7．棄去（回收）抗體稀釋液，用1×漂洗液漂洗3-5次，每次3分鐘。
8．進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。建議采用ECL試劑盒（YJ0049）進(jìn)行檢測(cè)。

常見(jiàn)問(wèn)題解答                
    
問(wèn)  題：信號(hào)太弱或者看不到條帶 
可 能 原因：
a蛋白上樣量太少
b蛋白轉(zhuǎn)膜效率太低
c一抗親和力較低
解決方案:
a進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)加大上樣量。
b優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時(shí)間或者電流，確保轉(zhuǎn)膜時(shí)膜與膠之間沒(méi)有氣泡。
c增加膜在溶液（含有mixture 1的WB-2）中的孵育時(shí)間。 
 增加抗體濃度可以增加信號(hào)。
d 對(duì)于低親和力抗體來(lái)說(shuō)，減少洗膜時(shí)間可以增加信號(hào)。     
由每次10min，減少到每次5min可以增加信號(hào)。                 
                                   
問(wèn)  題：背景偏高
可 能 原因：
a一抗使用過(guò)量
b一抗有非特異性結(jié)合或者與封閉試劑有交叉反應(yīng)
c洗膜時(shí)間太短
d曝光顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
e容器或者試劑被污染
解決方案:
A減少一抗的使用量，相應(yīng)的減少WB-1用量。
B使用pretreat A-b（M01052）。 客戶還可以使用Quick Block Optimization kit 來(lái)找到j(luò)ia的封閉試劑。
C增加洗滌的步驟可以進(jìn)一步的降低背景。
D減少曝光時(shí)間。如果信號(hào)和背景都高，可以等待一段時(shí)間，等背景信號(hào)減弱后，再進(jìn)行曝  光。
e每次洗滌的時(shí)候使用清潔的容器。帶手套，使用清潔的鑷子處理膜。

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