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激光共聚焦顯微鏡有激發(fā)針孔和探測針孔，激發(fā)針孔和探測針孔共軛(共焦)，共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面。
激發(fā)光經(jīng)激發(fā)針孔后成為點光源，然后通過二色鏡反射和物鏡聚焦點狀照射在樣品上，樣品被激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射光經(jīng)同一物鏡，聚焦在探測針孔。探測針孔后面是光電倍增管，非焦平面的光就不能通過針孔(pinhole)被光電倍增管檢測。
激光共聚焦顯微鏡的針孔(Confocal pinhole)一般指探測針孔(detection pinhole)，Confocal pinhole的直徑一般自動設(shè)置成和艾里斑(airy disc)直徑一致。
艾里斑是點光源通過理想透鏡成像時，由于衍射而在焦點處形成的光斑。中央是明亮的圓斑，周圍有一組較弱的明暗相間的同心環(huán)狀條紋，把其中以一暗環(huán)為界限的中央亮斑稱作艾里斑。
激光共聚焦顯微鏡的針孔和艾里斑的直徑大小一樣，將有84%的聚焦光到達(dá)光電倍增管，圖像的信噪比好。Confocal是逐點激發(fā)和逐點檢測，因此有更窄的點擴(kuò)散函數(shù)(Point spread function， PSF.
Confocal側(cè)向分辨率高于一般的光學(xué)顯微鏡，r(lateral)=0.61 λexc/NA(obj)，物鏡的軸向分辨率不如側(cè)向分辨率，r(axial)=1.4 λexc n/NA(obj)2
小的針孔將有更好的Z軸分辨率，但需更強(qiáng)的信號。
激光共聚焦顯微鏡優(yōu)點
1、以激光為光源，在相應(yīng)的熒光探針標(biāo)記后，對樣本進(jìn)行逐點掃描，逐層獲得二維光學(xué)橫斷面圖像，具有“細(xì)胞CT”的功能，并可通過計算機(jī)三維重建軟件支持，獲得三維圖像，并可以任意角度旋轉(zhuǎn)，觀察細(xì)胞，組織立體形態(tài)和空間關(guān)系;
2、可以對活細(xì)胞和組織進(jìn)行無損傷的觀察，動態(tài)測量細(xì)胞內(nèi)的Ca離子濃度和pH值等活細(xì)胞生理信息;
3、可對細(xì)胞膜的流動性，細(xì)胞間通訊，細(xì)胞融合，細(xì)胞骨架彈性測量等，可用作“光刀子”完成細(xì)胞內(nèi)“外科手術(shù)”。這一技術(shù)可以對活細(xì)胞和組織進(jìn)行原位動態(tài)定量的觀察和測量。
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