近幾十年來，在再生醫(yī)學(xué)域，生物制劑的應(yīng)用經(jīng)歷了飛速的發(fā)展。在生物制劑中，干細胞正逐漸成為重要的研究對象。研究表明，干細胞的治療作用可能通過旁分泌作用實現(xiàn)，外泌體作為細胞旁分泌的種生物活性物質(zhì)，成為近年來的研究熱點。

       單外泌體表型分析是將免疫學(xué)與光學(xué)成像結(jié)合的種新技術(shù)^[1]。該技術(shù)用免疫異性結(jié)合將定的外泌體進行捕獲分離，然后再對目標(biāo)外泌體的尺寸、分布、表面標(biāo)志物及內(nèi)容物（如攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA及細胞因子）進行定量分析，從而更加全面地反映外泌體的性。單個外泌體表型分析技術(shù)在短短兩年時間，備受廣大科研工作者的關(guān)注。本文收集了該技術(shù)在干細胞域的相關(guān)應(yīng)用，供您參考。

International   Journal of Molecular Sciences：含外泌體的干細胞提取物可促進組織再生

       間充質(zhì)干細胞（MSC）能夠分泌具有生物活性的分子如生長因子，細胞因子和外泌體，其中外泌體能夠調(diào)控其它細胞，在受損傷組織處產(chǎn)生再生性微環(huán)境，是MSC生理功能的載體。外泌體可作為無細胞的再生治療方法，相比于細胞治療具有更高的安全性，更低的免疫原性，不會誘發(fā)形成腫瘤，且尺寸較小，更容易遷移至靶點。Gupta等^[2]發(fā)現(xiàn)通過培養(yǎng)MSC獲得的含生長因子，細胞因子和外泌體的提取物能夠促進細胞增殖及誘導(dǎo)干細胞遷移以修復(fù)受損組織。聯(lián)系之前的研究成果，這些因子共同作用的結(jié)果可應(yīng)用于再生治療方法的開發(fā)。

       其中，研究人員使用納米粒子追蹤（NTA）法檢測了提取物中納米顆粒的濃度和外泌體的總濃度，并用ExoView同時檢測了提取物中含不同蛋白標(biāo)記物的外泌體的濃度、尺寸。結(jié)果可知，ExoView直接獲得了不同種類外泌體的濃度（圖1B）以及詳細的尺寸分布，眾數(shù)與均值（圖1C&D）。通過ExoView法還發(fā)現(xiàn)提取物中并沒有含CD63的外泌體。

圖1 A，NTA法檢測的提取物中納米顆粒濃度與外泌體濃度；

B，ExoView檢測的CD81和CD9外泌體濃度；

C，ExoView檢測的CD81和CD9外泌體尺寸分布；

D，ExoView檢測的CD81和CD9外泌體尺寸眾數(shù)與均值。

Cancer Cell Int：外泌體與miRNA調(diào)節(jié)成神經(jīng)管細胞瘤的干細胞性

       腦瘤中的部分細胞具有干細胞性，能夠自我更新并分化為不同細胞系。其中，成神經(jīng)管細胞瘤的病人有25%經(jīng)過傳統(tǒng)療法后5年內(nèi)復(fù)發(fā)并轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡，存活的病人也受到化療和放療的副作用和并發(fā)癥影響，因此需要種安全有效的治療方法。腫瘤細胞的外泌體含有miRNA，能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程并與抗藥性相關(guān)。有研究表明腫瘤干細胞的外泌體運載了腫瘤細胞有的miRNA，能夠產(chǎn)生有于腫瘤發(fā)展的微環(huán)境。Choi等^[3]研究了成神經(jīng)管細胞瘤的外泌體及運載的miRNA及其在腫瘤治療中的潛在作用。其中，miR-135b和miR-135a在腫瘤干細胞中高表達，抑制兩者會導(dǎo)致具有腫瘤抑制作用的Angiomotin?like 2（AMOTL2）表達上升，使腫瘤干細胞的干細胞性下降。

       其中，研究人員使用ExoView通過熒光成像檢測腫瘤細胞與腫瘤干細胞的外泌體標(biāo)記物，在兩種細胞的外泌體上均檢測到了Alix和Syntenin兩種膜內(nèi)蛋白，并且可以確定兩種膜內(nèi)蛋白與CD63/CD9外泌體標(biāo)記物共定位（圖2）。

圖2 Exoview檢測外泌體上的Alix（a）與Syntenin（b）蛋白

Cells：誘導(dǎo)性多能干細胞外泌體在急性腎損傷中的保護作用

       骨髓干細胞（MSC）具有治療急性腎損傷的作用，促進腎小管上皮細胞的增殖并抑制細胞凋亡，且MSC分泌的外泌體也有相似的作用。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)性多能干細胞（iPSC）具有抗炎、抗氧化和抗細胞凋亡，在其他腎損傷模型中起保護作用，且iPSC也可以分泌有心臟保護作用的外泌體。于是，Collino等^[4]研究了iPSC外泌體在急性腎損傷中的作用。結(jié)果表明，iPSC外泌體在腎損傷模型中表現(xiàn)出保護作用，主要體現(xiàn)于保護線粒體、降低氧化應(yīng)激與抗炎三個方面。

       其中，研究人員使用ExoView檢測了含有不同蛋白標(biāo)記物的iPSC外泌體的尺寸并統(tǒng)計了所有外泌體的尺寸分布。其中，含有CD81/CD63/CD9的外泌體直徑主要分布于50-110nm，CD44外泌體直徑主要分布于55-85nm（圖3）。

圖3 iPSC外泌體的尺寸分布

Nanoscale：溫敏水凝膠包被干細胞外泌體對術(shù)后腸痿的治療作用

       干細胞外泌體用于治療，若采用全身給藥，往往會被單核巨噬細胞清除導(dǎo)致外泌體到達患處的數(shù)量降低，影響治療效果。Berger 等^[5]采用了種溫敏水凝膠(Pluronic F-127 (PF-127)，poly (N-isopropylacrylamide))包被干細胞外泌體，通過表皮穿刺給藥來確認(rèn)外泌體對術(shù)后腸痿的治療作用。相對于含外泌體的生理鹽水的靜脈注射/穿刺給藥，水凝膠穿刺給藥的外泌體更容易到達并停留在患處，且治療效果更好。

       在凝膠包被前，研究人員使用Exoview檢測了的制備的外泌體表面的蛋白標(biāo)記物，確認(rèn)外泌體表面含有CD81和CD63，而含CD9外泌體較少（圖4A）；進步使用熒光成像可以確認(rèn)外泌體不含Calnexin（外泌體的陰性標(biāo)記），表示外泌體未被污染（圖4B）。

圖4 ExoView檢測外泌體蛋白標(biāo)記物（A）與外泌體是否被污染（B）

       綜上所述，Exoview作為新代的外泌體表征系統(tǒng)，不僅能夠勝任傳統(tǒng)外泌體表征系統(tǒng)的工作完成對外泌體的尺寸和分布進行統(tǒng)計，并且能夠?qū)⑦@種統(tǒng)計細化提供不同亞型外泌體之間分布及其表型的區(qū)別。提供更為詳實的外泌體研究數(shù)據(jù)，幫助研究者更好的研究干細胞來源的外泌體在心血管系統(tǒng)、外傷性腦損傷、肌肉骨骼系統(tǒng)、腎損傷等方面的強大修復(fù)再生和保護能力，闡明其中的機理。為再生醫(yī)學(xué)治療的提供種全新的分析手段。

參考文獻：

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[2] Gupta, A., Cady, C., Fauser, A. M., Rodriguez, H. C.,   Mistovich, R. J., Potty, A. G., & Maffulli, N. (2020). Cell-free Stem   Cell-Derived Extract Formulation for Regenerative Medicine Applications.   International Journal of Molecular Sciences, 21(24), 9364.

[3] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J.   H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated   miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by   targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

[4] Collino, F., Lopes, J. A., Tapparo, M., Tortelote, G. G.,   Kasai-Brunswick, T. H., Lopes, G., ... & Lindoso, R. S. (2020).   Extracellular vesicles derived from induced pluripotent stem cells promote   renoprotection in acute kidney injury model. Cells, 9(2), 453.

[5] Berger, A., Araújo-Filho, I., Piffoux, M., Nicolás-Boluda,   A., Grangier, A., Boucenna, I., ... & Silva, A. K. (2021). Local administration   of stem cell-derived extracellular vesicles in a thermoresponsive hydrogel   promotes a pro-healing effect in a rat model of colo-cutaneous post-surgical   fistula. Nanoscale, 13(1), 218-232.

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡介

       Nanoview所開發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）是款無需純化的全自動的新型外泌體表征設(shè)備。該設(shè)備能夠提供外泌體表征信息，包括顆粒大小、計數(shù)、表型與生物標(biāo)志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測量解決方案。ExoView R100允許研究者直接分析定群體的外泌體或外囊泡。通過ExoView芯片，客戶能夠直接多分析9個不同的樣本，節(jié)省成本、時間，并減少純化所帶來的偏差。為了更好的服務(wù)您的科研工作，Quantum   Design中國也建立了樣機演示實驗室，可以為您提供業(yè)的售前、銷售、售后技術(shù)支持，歡迎老師參觀試用！