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細胞逆轉錄酶(REVERSE TRANSCRIPTASE)

來源:上海銘博生物科技有限公司   2021年03月10日 09:51  

MB50353.1 v.A

 

  細胞逆轉錄酶(REVERSE TRANSCRIPTASE)活性熒光定量檢測試劑盒

產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

  細胞逆轉錄酶(REVERSE TRANSCRIPTASE活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物,在dTTP的參與下,通過逆轉錄酶的催化,聚合產生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子,由PicoGreen特異染色,即采用熒光法來測定細胞裂解樣品中酶活性*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品(動物、人體、昆蟲等)逆轉錄酶的活性,以及抑制劑檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。

 

技術背景

 

逆轉錄酶(REVERSE TRANSCRIPTASEEC2.7.7.49),又稱為RNA依賴性DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase),是將單鏈RNA分子轉錄為雙鏈DNADNA聚合酶,包括HIV逆轉錄酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus;MMLV)逆轉錄酶、禽類成髓細胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus;AMV)逆轉錄酶、端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase) 等。逆轉錄病毒使用逆轉錄酶達到逆轉錄RNADNA,然后整合到宿主基因組再復制。在真核生物中,端粒酶是一種逆轉錄酶。逆轉錄酶在分子生物學中得到廣泛運用。檢測逆轉錄酶活性成為病毒感染的監(jiān)測手段,同時作為藥物篩選的靶標。基于poly-A模板與oligo-dT引物構成的雙鏈分子底物,在dTTP的參與下,通過逆轉錄酶的催化,聚合產生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子(heteroduplexes),由PicoGreen特異染色,根據(jù)熒光強度分析(激發(fā)波長480nm,散發(fā)波長520nm),來定量測定逆轉錄酶的活性。 

 

產品內容

 

  清理液(Reagent A 毫升

  裂解液(Reagent B 毫升

  緩沖液(Reagent C 毫升

  底物液(Reagent D 微升

  終止液(Reagent E 微升

  染色液(Reagent F 微升

  稀釋液(Reagent G 毫升

  標準液(Reagent H 微升

產品說明書    1

 

保存方式

 

保存  清理液(Reagent A4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里;  染色液(Reagent F避免光照;有效保證6

 

 

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒:用于細胞脫離

DOUNCE勻漿器:用于裂解組織

臺式離心機:用于樣品操作

比色皿或酶標板:用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀:用于熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的  裂解液(Reagent B置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

  • 樣品準備

 

  • 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞(15 X 106細胞)
  • 小心加入xx毫升  清理液(Reagent A,覆蓋生長表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入xx毫升  清理液(Reagent A,混勻細胞
  • 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始
  • 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入置于冰槽里的xx微升  裂解液(Reagent B 
  • 強力渦旋震蕩30秒,充分混勻
  • 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
  • 在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約80下)
  • 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
  • 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g
  • 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-   30030.1
  • 放進-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

  • 測定準備

 

  • 準備好待測樣品(例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等),置于冰槽里
  • 設定好熒光酶標儀(溫度為25℃):激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長520nm
  • 準備好51.5毫升離心管,標記為15號管
  • 分別加入xx微升  裂解液(Reagent B15號管
  • 移取xx微升  標準液(Reagent H1號管,混勻
  • 小心移取xx微升1號管稀釋的  標準液(Reagent H2號管,混勻
  • 小心移取xx微升2號管稀釋的  標準液(Reagent H3號管,混勻
  • 小心移取xx微升3號管稀釋的  標準液(Reagent H4號管,混勻
  • 15號管放進冰槽里備用;標準管濃度見下表

 

管號

  裂解液(Reagent B

  標準液(Reagent H

測定體系標準DNA濃度

1

xx微升

xx微升

xx納克/毫升

2

xx微升

xx微升1號管

xx納克/毫升

3

xx微升

xx微升2號管

xx納克/毫升

4

xx微升

xx微升3號管

xx納克/毫升

5

xx微升

0

0

 

三、標準曲線構建

 

測定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液(Reagent F置入冰槽里融化,然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管,加入xx微升  稀釋液(Reagent G,輕柔混勻后,置于冰槽里,標記為  反應工作液(注意:5次操作量),放在暗室里備用。然后進行下列操作

 

  • 96孔板上做好相應標記:標準樣品
  • 移取xx微升  緩沖液(Reagent C96孔板應孔
  • 分別加入xx微升  底物液(Reagent D
  • 分別加入5微升上述配制的標準液
  • 分別加入xx微升  終止液(Reagent E
  • 分別加入xx微升  染色工作液
  • 室溫下孵育5分鐘,避免光照
  • 即刻放進熒光酶標儀檢測:獲得相對熒光讀數(shù)RFURelative Fluorescence Unit
  • 實際熒光讀數(shù):標準樣品相對熒光讀數(shù)-5號管標準樣品相對熒光讀數(shù)(作為背景空對照)
  • 構建標準曲線:縱座標(Y軸)為實際熒光單位RFU;橫座標(X軸)為標準DNA濃度(納克/毫升

 

四、樣品測定

 

測定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液(Reagent F置入冰槽里融化,然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管,加入xx微升  稀釋液(Reagent G,輕柔混勻后,置于冰槽里,標記為  反應工作液(注意:5次操作量),放在暗室里備用。然后進行下列操作

 

  • 96孔板上做好相應標記:待測樣品
  • 移取xx微升  緩沖液(Reagent C96孔板應孔
  • 加入xx微升  底物液(Reagent D
  • 加入5微升待測樣品(注意:10微克純化酶蛋白或50微克裂解懸液蛋白)
  • 室溫下孵育60分鐘
  • 分別加入xx微升  終止液(Reagent E
  • 分別加入xx微升  染色工作
  • 室溫下孵育5分鐘,避免光照
  • 即刻放進熒光酶標儀檢測:獲得相對熒光讀數(shù)RFURelative Fluorescence Unit
  • 實際熒光讀數(shù):待測樣品相對熒光讀數(shù)-5號管標準樣品相對熒光讀數(shù)(作為背景空對照)
  • 根據(jù)標準曲線獲得樣品對應DNA濃度(納克/毫升
  • 實際活性計算:

 

注意事項

 

  • 本產品為20次操作
  • 操作時,須戴手套
  • 系統(tǒng)操作過程中,標準曲線測定只需1
  • 樣品須澄清,至關重要
  • 樣品中避免使用EDTA、EGTANaCl、MgCl2、Triton X-100
  • 反應完成即刻進行熒光測定
  • 測定值由變化
  • 樣本測定樣品讀數(shù)背景讀數(shù)表明具有酶活性
  • 待測樣本為粗提酶樣品,其蛋白濃度為10微克/5微升;待測樣本為細胞裂解懸液,其蛋白濃度為50微克/5微升(本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒   30030.1
  • 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度
  • 逆轉錄酶單位活性定義為:在25,pH 8.1條件下,每小時內能夠轉錄1納克DNA所需的酶量作為一個活性單位
  • 本公司提供系列逆轉錄酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

  • 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產品經鑒定檢測敏感

 

 

免責聲明

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