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多色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞類型
多色流式細(xì)胞術(shù)是一種強(qiáng)大的技術(shù)，用于分析細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞類型中表達(dá)的蛋白質(zhì)。對于許多類型的細(xì)胞，如Th17細(xì)胞，細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的結(jié)合使用是必要的明確的表型鑒定。表征信號響應(yīng)于特定的靶細(xì)胞的性質(zhì)，可用于表面標(biāo)志物的同時分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
細(xì)胞表面染色的技術(shù)是比較標(biāo)準(zhǔn)的，往往依賴于目標(biāo)蛋白的生物學(xué)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的染色。根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的位置，與其他分子，它的穩(wěn)定性，不同的細(xì)胞制備和染色方法的建議。細(xì)胞因子，例如，典型的分泌蛋白。但是，如果它們在細(xì)胞內(nèi)被困住的，它們可以被污染：BD GolgiStop的?（含莫能菌素）或BD GolgiPlug的?（含布雷菲德菌素甲）如使用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子是相對使用的溫柔固定和通透賦予由BD Cytofix / Cytoperm?固定和透化解決方案訪問。
相反，細(xì)胞因子，轉(zhuǎn)錄因子通常被定位在細(xì)胞核內(nèi)DNA和其他蛋白質(zhì)結(jié)合。一些蛋白質(zhì)的磷酸化，如Stat5的，導(dǎo)致二聚體的形成，還掩蓋了磷酸化的表位。此外，細(xì)胞內(nèi)磷酸酶可以快速去磷酸化蛋白。因此，處理后的細(xì)胞，必須迅速地固定，并進(jìn)行更強(qiáng)的通透條件允許抗體進(jìn)入細(xì)胞核并進(jìn)入破壞的分子復(fù)合物的抗原表位內(nèi)。
所用的透化技術(shù)產(chǎn)生負(fù)面影響的細(xì)胞表面和其他細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測。允許進(jìn)入細(xì)胞核，并打開DNA /蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復(fù)合物的相同的技術(shù)往往能細(xì)胞表面抗原變性，防止其被抗體的檢測。雖然不同的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的檢測可能需要不同的條件，基本原則是相同的：細(xì)胞是固定的，通透的，然后用熒光抗體染色細(xì)胞。
細(xì)胞內(nèi)染色的基本原則細(xì)胞固定和通透（象征虛線膜），染色，然后用流式細(xì)胞儀分析。對于分泌的蛋白質(zhì)的研究中，細(xì)胞首先與一種蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑治療的目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，以允許..
胞內(nèi)流式細(xì)胞儀BD工具為了促進(jìn)BD流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)，已經(jīng)開發(fā)了幾個包，緩沖區(qū)和協(xié)議。此外，許多關(guān)鍵的細(xì)胞表面標(biāo)志的特定熒光抗體測試幾個緩沖系統(tǒng)，以節(jié)省研究人員的時間，樣品，和金錢。常用的為特定的應(yīng)用程序的BD緩沖器包括：
檢測細(xì)胞因子BD Cytofix / Cytoperm的固定/通透的解決方案（編號：554722）是適用于染色大多數(shù)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面標(biāo)志。該緩沖系統(tǒng)也可用于一些轉(zhuǎn)錄因子和其它細(xì)胞內(nèi)蛋白染色。該緩沖系統(tǒng)包含溫和的洗滌劑以及與甲醛固定液。
轉(zhuǎn)錄因子是專為BD Pharmingen公司的轉(zhuǎn)錄因子的緩沖液設(shè)置（部件號五十六萬二千七百二十五分之五十六萬二千五百七十四）單獨(dú)或結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄因子染色。該緩沖系統(tǒng)包含溫和的洗滌劑以及與甲醛固定液。
檢測磷酸化蛋白的BD Phosflow?燙發(fā)緩沖III（貨號：558050）推薦的通透緩沖通過流式細(xì)胞儀phosphoepitope檢測。彼爾姆緩沖III是一個嚴(yán)酷的以酒精為基礎(chǔ)的緩沖區(qū)。也可替代通透性緩沖區(qū)，以適應(yīng)特定的實驗要求。
優(yōu)化細(xì)胞通透性條件不同表位的位置的通透條件決定的抗原表位的細(xì)胞內(nèi)的無障礙。磷酸701表位（橙色）位于的STAT蛋白二聚體，而磷酸絲氨酸727表位是位于外二聚化地區(qū)。對于的磷酸701網(wǎng)站，如燙發(fā)緩沖III染色所需的更嚴(yán)厲的緩沖。以誘導(dǎo)蛋白的磷酸化，人外周血單核細(xì)胞（PBMCs）被留下未處理的（ - ）或（+）激活的人IFN-α（急性髓pY701）或PMA（急性髓pS727）。細(xì)胞被固定使用BD Cytofix?固定緩沖通透使用BD Phosflow?燙發(fā)緩沖區(qū)I，II，III，IV，染色前用熒光磷酸化抗體。
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