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流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)研究的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)
隨著收集數(shù)據(jù)的能力，在單個(gè)細(xì)胞的水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)研究提供了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)流式細(xì)胞儀與裂解為基礎(chǔ)的方法，有利于異構(gòu)信號(hào)反應(yīng)的檢測(cè)和分析。因此，有可能區(qū)分一個(gè)強(qiáng)大的蛋白磷酸化響應(yīng)于一個(gè)更小的，但更均勻的響應(yīng)細(xì)胞與一小口。此外，特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物的復(fù)雜的細(xì)胞混合物，如全血細(xì)胞亞群內(nèi)的熒光抗體，蛋白磷酸化介導(dǎo)的信號(hào)反應(yīng)可以檢測(cè)到。此外，罕見的細(xì)胞群無預(yù)富集的細(xì)胞可以被發(fā)現(xiàn)。其結(jié)果是，獲得豐富的數(shù)據(jù)，從有限的細(xì)胞樣品。
BD的?Phosflow產(chǎn)品包括一個(gè)系統(tǒng)優(yōu)化的緩沖液和熒光單克隆抗體的流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子和特定的翻譯后修飾。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)特定的磷酸化的抗原表位，細(xì)胞固定，并維持的信號(hào)??蛋白的磷酸化狀態(tài)，然后透性，以允許進(jìn)入細(xì)胞特異性結(jié)合靶蛋白的抗體。流式細(xì)胞儀分析染色的細(xì)胞，就可以捕獲細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白磷酸化的一個(gè)“快照”。
蛋白磷酸化是短暫的性質(zhì)，嚴(yán)重受蛋白磷酸酶。適當(dāng)?shù)拇碳r(shí)間點(diǎn)都需要及時(shí)滅活磷酸磷蛋白檢測(cè)方法，包括Western blot分析。同樣，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞樣品必須被迅速固定保持phosphoepitopes。另一個(gè)重要因素是磷蛋白的表達(dá)水平。某些蛋白質(zhì)的磷酸化事件可以是困難的，特別是當(dāng)在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)一個(gè)特定的信號(hào)蛋白的水平低，或表現(xiàn)出不完整的感興趣的部位的磷酸化。BD提供高品質(zhì)的明亮的熒光抗體直接結(jié)合，大大提高了細(xì)胞內(nèi)磷酸化檢測(cè)。
人類外周血單核細(xì)胞進(jìn)行染色的Alexa Fluor?647抗人CD127的抗體在15分鐘的刺激0 - 0.01，0.1-，1 - ，10 - ，或100-ng/mL重組人IL-2的劑量的。固定細(xì)胞，使用BD Cytofix固定緩沖液，使用BD Phosflow的燙發(fā)緩沖液III透性，并與熒光Stat5的（pY694）的特異性抗體，CD4，CD8，和CD25的染色。樣品采集使用BD LSRFortessa?流式細(xì)胞儀系統(tǒng)，，并分析使用Cytobank軟件。CD4 + T細(xì)胞亞群被確定，如圖所示。相比其他T細(xì)胞，Stat5的磷酸化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在IL-2的濃度低得多。
多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的檢測(cè)和分析復(fù)雜混合物中的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞亞群的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。由于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究往往未受刺激的刺激或抑??制分子，本文由中藥標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品研究中心整理提供或未經(jīng)處理的細(xì)胞治療研究細(xì)胞反應(yīng)往往提供的評(píng)估背景染色的控制。與免疫球蛋白同種型對(duì)照，未刺激的細(xì)胞控制考慮到各抗體的*的背景特征以及基底感興趣的細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞通透性需要暴露磷酸化的抗原表位。雖然多個(gè)緩沖系統(tǒng)，BD Phosflow的燙發(fā)緩沖III建議對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用程序。BD Biosciences公司的網(wǎng)站包含有用的信息，各種BD細(xì)胞表面標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)抗體在不同的緩沖條件和染色協(xié)議的性能。
BD Phosflow套件提供了有用的工具，用于分析的適應(yīng)性和先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞所引起的信號(hào)反應(yīng)。這些套件包括熒光抗體雞尾酒特異的細(xì)胞表面標(biāo)志確定具體的白細(xì)胞亞群以及熒光抗體主要磷酸化。此外，該套件提供兼容的緩沖區(qū)，陽性和陰性對(duì)照細(xì)胞，以及詳細(xì)的協(xié)議。人單核細(xì)胞/ NK細(xì)胞的活化試劑盒（目錄號(hào)562089）的BD Phosflow?允許同時(shí)研究從人全血中的B細(xì)胞，T細(xì)胞，單核細(xì)胞，NK細(xì)胞中的蛋白磷酸化，而的BD Phosflow?人T-細(xì)胞活化試劑盒（貨號(hào)：560750）是有用的CD4與CD8 + T細(xì)胞中的磷酸化反應(yīng)的研究。
人全血刺激的人IL-4和固定，透化，染色使用BD Phosflow人類單核細(xì)胞/ NK細(xì)胞激活工具箱。樣品采集，并通過流式細(xì)胞儀使用的BD LSRFortessa?細(xì)胞分析儀，然后分析使用Cytobank軟件的分析。白細(xì)胞的子集被確定，如圖所示。STAT6的（pY641）和Stat5（pY694）磷酸化反應(yīng)的的IL-4的分析結(jié)果顯示，所有四個(gè)白細(xì)胞亞群通過磷酸化STAT6的IL-4。相比之下，Stat5的反應(yīng)差別很大之間的細(xì)胞類型，不顯示檢測(cè)STAT5磷酸化響應(yīng)與NK細(xì)胞。
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