MB50246.3 v.A

   細菌P型ATP酶（P type ATPase）活性酶連續(xù)反應光度法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

   細菌P型ATP酶（P type ATPase）活性酶連續(xù)反應光度法定量檢測試劑是一種旨在使用P型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，在釩酸鹽存在與否的情況下，受到P型ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細菌細胞P型ATP酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術背景

腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。ATP酶的去磷酸化反應釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進出細胞。根據(jù)ATP酶的結構和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型ATP酶，又稱為E1-E2 ATP酶，通常由一條或兩條多肽構成，且呈現(xiàn)兩種主要的結構構象E1和E2。這類ATP酶存在于細菌和真核細胞膜和細胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運輸各種化學分子，包括離子和磷脂，例如H⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等。P型ATP酶可以分成三型：I型（細菌重金屬離子型）、II型（動物Na/K、H/K、SERCA、PMCA、真菌和植物HA）、III型（細菌K）和四種，Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細菌型等。 基于ATP，在P型ATP酶抑制劑釩酸鹽（vanadate）存在與否的情況下，受到P型ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析P型ATP酶的特異活性。其反應系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

   裂解液（Reagent A）   毫升

   緩沖液（Reagent B）      毫升

   酶促液（Reagent C）           微升

   反應液A（Reagent D1）      毫升

   反應液B（Reagent D2）      毫升

   底物液（Reagent E） 毫升

   陰性液（Reagent F）   毫升

   專性液（Reagent G）   毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存   反應液B（Reagent D2）在4℃冰箱，其余的在－20℃冰箱里，避免反復凍融；   底物液（Reagent E），避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；   底物液（Reagent E）注意避光。然后進行下列操作。

• 樣品準備（總蛋白制備）

• 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升   裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里30分鐘，期間強力渦旋震蕩15秒三次
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g 
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1；使用   裂解液（Reagent A）作為陰性對照）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準備

• 準備好待測樣品，置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零
•    緩沖液（Reagent B）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   反應液A（Reagent D1）
• 加入xx微升   反應液B（Reagent D2）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升   陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

四、樣品總活性測定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   反應液A（Reagent D1）
• 加入xx微升   反應液B（Reagent D2）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

五、樣品非特異活性測定

• 移取xx微升   緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入xx微升   酶促液（Reagent C）
• 加入xx微升   專性液（Reagent G）
• 加入xx微升   底物液（Reagent E）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

• 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為21次操作（10個樣本），包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用質膜樣品為佳（   細菌可溶性膜蛋白制備試劑盒—GMS30022.2）
• 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
• 加入樣品啟動反應后3秒內(nèi)即刻光度測定
• 反應測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)30分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供    Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 樣品特異活性是指釩酸鹽敏感的P型ATP酶
• P型ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類分析技術產(chǎn)品

質量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確