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Elisa試劑盒競爭法測抗原的原理與步驟
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測一般采用此法。
實驗步驟
1. 以稀釋液將待檢標本做適當(dāng)稀釋（預(yù)試中確定）加入包被有已知抗原的酶標板中（50ul/孔），加封口膠帶于37℃作用30min。
2. 棄反應(yīng)液，以沖洗液連續(xù)洗板5次并于吸水紙上拍干。
3. 加入酶標抗體（濃度在預(yù)試中確定）。加封口膠帶后于37℃作用30min。
4. 重復(fù)第2步。
5. 加底物（濃度在預(yù)試中確定），加封口膠帶后于室溫下避光作用5-60 min，其間不時觀察，顯色滿意后加終止液50ul/孔。
6. 于酶標儀測定OD值，OPD用492nm測定，TMB用450nm測定。
注意事項
1. 每次實驗均應(yīng)做陰性對照、陽性對照及空白對照（以PBS代替標本），后者為本底值，在分析實驗結(jié)果時應(yīng)扣除本底值，陽性對照<陰性對照<空白對照實驗成立。
2. 一般認為小分子抗原宜用本法檢測，而大分子抗原則宜采用夾心法檢測，但具體宜采用哪種方法應(yīng)根據(jù)試驗決定，本發(fā)與夾心法相比在操作上減少一步。包被抗體與酶標抗體如果分別采用單克隆抗體和多克隆抗體時，宜用單克隆抗體作為包被抗體，以多克隆抗體作為酶標抗體。
3. 血清標本中抗原濃度一般較低，故一般用原倍標本進行檢測，必要時可進行稀釋測定，但應(yīng)重新摸索酶標抗原的濃度，以確保方法的靈敏性。
4. 以酶標記抗原的方法同酶標記抗體。
5. 其它注意事項同酶聯(lián)免疫間接法。
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