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新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細胞培養(yǎng)

來源:上海喆圖科學(xué)儀器有限公司   2021年05月21日 14:23  

      背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細胞起源于神經(jīng)嵴,NGF Levi-Montalcini的實驗表明,外原性NGF能刺激DRG細胞生長發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在體外,分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下,神經(jīng)突起的生長在一天之內(nèi)可長達數(shù)毫米,因此,利用培養(yǎng)的DRG細胞,進行軸突生長發(fā)育的研究,是最為經(jīng)典而常用的方法之一。二氧化碳培養(yǎng)箱是通過對周圍環(huán)境條件的控制制造出一個能使細胞/組織更好地生長的環(huán)境,條件控制的結(jié)果就會形成一個穩(wěn)定的條件:如恒定的酸堿度(pH值:7.2-7.4)、穩(wěn)定的溫度(37°C)、較高的相對濕度(95%)、穩(wěn)定的CO2水(5%)。因此,動物細胞的培養(yǎng)少不了用它。

        

       1、材料和方法

取新生一天的大鼠(wistar種)和小鼠(昆明種)。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側(cè)朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。 剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105 個細胞/ml密度的細胞懸液,接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml細胞懸液置。置標(biāo)本于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液,以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

       

       2、培養(yǎng)液成份

種植培養(yǎng)液:80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清;10%馬血清;NGF 20ng/ml;谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3  3.7g/L,);5 % 馬血清;NGF 20ng/ml;神經(jīng)營養(yǎng)素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

 

       3、新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元接種后4h,大部分細胞可貼壁,呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm, 胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經(jīng)元的細胞核位于中央或偏于胞體一側(cè),核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h,大部分貼壁細胞開始長出突起。其中多數(shù)為具有多個突起的多極神經(jīng)元,少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元,突起細長,并可觀察到突起末端的生長錐。除單個散布的神經(jīng)元外,還常見到幾個或多個神經(jīng)元聚集在一起,它們向四周發(fā)出樹枝狀的神經(jīng)突起。 培養(yǎng)2-3d后神經(jīng)元的突起逐漸增多并延長,形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長并增粗,神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密,神經(jīng)元胞體逐漸增大。大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可在二氧化碳培養(yǎng)箱維持培養(yǎng)2個月。

 

       4、新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長分化基本上與新生大鼠相似,但小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的胞體較大鼠稍小。神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大。小鼠背根節(jié)神經(jīng)元亦可在二氧化碳培養(yǎng)箱維持培養(yǎng)2個月。

 

       5、雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節(jié)神經(jīng)元以假單極為多見。 與大鼠或小鼠背根節(jié)培養(yǎng)神經(jīng)元相比,神經(jīng)突起分枝較少。神經(jīng)元胞體稍小,神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大。雞胚背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個月。

 

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