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神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

來源:上海喆圖科學(xué)儀器有限公司   2021年05月21日 14:44  

     (一)雪旺細(xì)胞

       雪旺細(xì)胞(Schwann cell,SC)是外周神經(jīng)系統(tǒng)最主要的膠質(zhì)細(xì)胞,也是外周神經(jīng)的成髓鞘細(xì)胞;它形成髓鞘,或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細(xì)胞的功能極其活躍,一旦神經(jīng)受損,它能反應(yīng)性分裂增殖,分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附分子,對神經(jīng)元及其軸突起營養(yǎng)和修復(fù)作用。近年來的研究表明,雪旺細(xì)胞也能促進(jìn)中樞神經(jīng)對脫髓鞘損傷的修復(fù),如對脊髓的再生,對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及對隔-海馬通路再生等。

 

       1、材料和方法

       雪旺細(xì)胞培養(yǎng)取材于各類哺乳動物的外周神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié),取孵化8-12d雞胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流產(chǎn)的人胎兒,在無菌條件下用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié),剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養(yǎng)液( 90% DMEM,10 % 胎牛血清,2mM谷氨酰胺)吹打分散成細(xì)胞懸液,先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中,于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育30 min后,翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液,除去已貼壁的成纖維細(xì)胞,再接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,種植密度為0.2×105個細(xì)胞/ml,每皿2ml細(xì)胞懸液置。置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第3 d,在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml,以進(jìn)一步去除成纖維細(xì)胞,作用48小時后更換新鮮培養(yǎng)液,以后每周換液兩次,每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

 

       2、雪旺細(xì)胞的生長和形態(tài)特征

       培養(yǎng)15d后可獲得較高純度的雪旺細(xì)胞,雪旺細(xì)胞呈雙極梭狀,核卵居中,相互平行排列,經(jīng)S-100免疫組織化學(xué)染色呈陽性反應(yīng)。增殖分裂的雪旺細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng),也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

 

     (二)星形膠質(zhì)細(xì)胞

       星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大,數(shù)量最多的一種,胞體呈星形,核大,呈卵圓形,染色質(zhì)稀少,星形膠質(zhì)細(xì)胞分兩類,一類為原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞(protoplasmic astrocyte),其突起短粗,分枝多。另一種為纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞(fibrous astrocyte),它的突起細(xì)長,分枝少。纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞是與少突膠質(zhì)細(xì)胞源自同一前體細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有多種功能,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元及其突起間的空隙幾乎全部由星形膠質(zhì)細(xì)胞充填,起結(jié)構(gòu)的支持作用,星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起構(gòu)成血腦屏障,星形膠質(zhì)細(xì)胞能攝取和代謝某些神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸等。

 

     (1)方法和結(jié)果

       選擇出生 2 d 的SD大鼠,無菌條件下分離出大腦皮層,用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養(yǎng)液( 90% DMEM,10 % 胎牛血清,2mM谷氨酰胺)吹打分散成細(xì)胞懸液,先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中,于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育30 min后,翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液,除去已貼壁的成纖維細(xì)胞,再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中, 種植密度為1×105 個細(xì)胞/cm2,每瓶10ml細(xì)胞懸液置。置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2 次,培養(yǎng)10-14h,細(xì)胞分為兩層,下一層為I型膠質(zhì)細(xì)胞即原漿形膠質(zhì)細(xì)胞,上一層是O-2A前體細(xì)胞,根據(jù)兩類細(xì)胞貼壁能力的差異,以振蕩培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行分選,在37℃搖床上振蕩,16 h(180r/min)O-2A前體細(xì)胞可被搖下來,搖下來的細(xì)胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)液使用20 % 胎牛血清促進(jìn)O-2A前體細(xì)胞分化為II型膠質(zhì)細(xì)胞即纖維型膠質(zhì)細(xì)胞??煞至言鲋车脑瓭{形膠質(zhì)細(xì)胞和纖維型膠質(zhì)細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng),也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆?。純度鑒定可用膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(GFAP)染色確定。

 

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