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高效液相色譜儀是在經(jīng)典液相色譜儀的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜儀的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜儀。高效液相色譜儀按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。
一、液固色譜法
使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于高效液相色譜儀分離同分異構(gòu)體。
二、液液色譜法
使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。
涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性;流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失;溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化;另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法：采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷)，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。
反相色譜法：一般用非極性固定相(如C18、C8);流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用Z為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)高效液相色譜儀應(yīng)用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8)，太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。
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