普通的Taq DNA 聚合酶的最適溫度是72℃，此時(shí)酶的活性最佳，低于此溫度，酶有較弱活性。在PCR擴(kuò)增的升溫過程中，酶發(fā)揮較弱的活性，體系極易錯(cuò)配或形成引物二聚體，尤其是當(dāng)設(shè)計(jì)的引物3’端是G 或C，錯(cuò)配的鏈很難重新解開。非特異性擴(kuò)增正是由于DNA聚合酶低溫下具有活性而引起的錯(cuò)誤引導(dǎo)靶標(biāo)延伸和引物二聚體形成的。

非特異性擴(kuò)增的具體影響包括：

• 目標(biāo)擴(kuò)增子產(chǎn)量低；

• 目標(biāo)擴(kuò)增子的靈敏度下降；

• 下游應(yīng)用效果不佳。

因此，要提高PCR 擴(kuò)增的特異性和降低反應(yīng)錯(cuò)配率，可以人為的控制酶的活性，在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性，這樣就避免了在升溫（或配置反應(yīng)體系）過程中發(fā)生鏈的錯(cuò)配，從而保證擴(kuò)增的特異性。

而目前常用的提高PCR特異性的方法是使用熱啟動(dòng)型Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，即熱啟動(dòng)PCR。

熱啟動(dòng)PCR，主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱到變性溫度時(shí)修飾物失活，酶活得以釋放，從而使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行。

熱啟動(dòng)PCR的優(yōu)勢(shì)：

• 阻止引物與低同源性的模板序列結(jié)合；

• 在PCR反應(yīng)開始之前，防止引物與引物之間形成引物二聚體；

• 提高目的片段的擴(kuò)增靈敏度和產(chǎn)量；

• 可在室溫下配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)程序，使操作更為便利，且不會(huì)影響擴(kuò)增性能和特異性。

熱啟動(dòng)Taq DNA 聚合酶常用的修飾方法有化學(xué)修飾法、抗體法和配體修飾法等。其中化學(xué)修飾法和抗體法最為常用。雖然它們都能抑制室溫下的聚合酶活性，但兩者之間存在一些差異。

但是，酶激活時(shí)間較長可能會(huì)影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。

檸康酸酐與酶結(jié)合的原理

一般認(rèn)為Taq DNA聚合酶上賴氨酸基團(tuán)有42個(gè)左右，但是由于空間結(jié)構(gòu)限制，其中一部分賴氨酸基團(tuán)在基團(tuán)內(nèi)部，無法與化學(xué)修飾基團(tuán)相結(jié)合。

但其缺點(diǎn)是抗原抗體結(jié)合是一種動(dòng)態(tài)平衡，試劑配比優(yōu)化時(shí)間長。

抗體與DNA聚合酶特異性結(jié)合封閉原理示意圖

兩種熱啟動(dòng)修飾方法的比較

熱啟動(dòng)PCR目前的應(yīng)用已是非常廣泛，在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如基因組DNA、單拷貝序列的擴(kuò)增、多重PCR和超長片段的擴(kuò)增中的應(yīng)用尤為突出。

優(yōu)質(zhì)的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，能有效降低或消除非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體的形成，提高引物與模板結(jié)合的效率。

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主要參考資料:

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