BY4741 感受態(tài)細(xì)胞操作方法(以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行)
1 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中,如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無菌預(yù)冷的離心管中,置于冰浴中。
● 一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100 μl,可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA 體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。
以下實(shí)驗(yàn)以100 μl感受態(tài)細(xì)胞為例。
2 向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA(100 μl 的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1 ng 超螺旋質(zhì)粒DNA 所飽和),輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物,在冰浴中靜置30 分鐘。
3 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 秒,然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻2-3 分鐘,該過程不要搖動(dòng)離心管。
4 向每個(gè)離心管中加入900 μl 無菌的SOC 或LB 培養(yǎng)基(不含抗生素), 混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 小時(shí)(160-220 轉(zhuǎn)/分鐘),目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá),使菌體復(fù)蘇。
5 將離心管內(nèi)容物混勻,吸取100 μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB 或LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收,倒置平板,37℃培養(yǎng)12-16 小時(shí)。
● 涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA 總量較多,可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板;反之,如轉(zhuǎn)化的DNA 總量較少,可取200-300 μl 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較少,可通過離心(4,000 rpm, 2分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液,懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板)
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