Gibson Assembly原理

Gibson Assembly原理示意圖

In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能夠識別3’末端堿基，具有3’→5’外切酶活性的特點。通過In-Fusion酶產(chǎn)生5’黏性末端，互補(bǔ)重疊片段退火配對；再將重組片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，重組片段序列中的缺刻在菌體內(nèi)進(jìn)行連接，獲得重組序列。

無縫克隆的優(yōu)勢

• 不受酶切位點限制

• 適用于任意載體、任意片段

• 一步連接1或多個片段，連接多片段耗時短

• 插入目的片段兩端不會添加額外序列（如保護(hù)堿基）

無縫克隆實驗關(guān)鍵影響因素

片段質(zhì)量

• 確保DNA片段無核酸酶及其它酶污染、無乙醇等殘留；

• 純度正常：A260/A280值在1.6-1.9、A260/230值在2左右、紫外吸收峰圖正常；

• 濃度正常：插入片段與線性化載體濃度高于50 ng/μl，會使重組效率提高；

• 若模板濃度低、純度低，則連接效率降低。

載體線性化方法

線性化載體可以選擇反向PCR或酶切的方法：

• 可根據(jù)在載體插入位置是否有合適的酶切位點選擇具體方法。因Gibson Assembly反應(yīng)體系內(nèi)無雙鏈DNA連接酶，不會發(fā)生載體自連，線性化載體不需要進(jìn)行末端去磷酸化處理。酶切制備線性化載體建議使用雙酶切，且酶切后采用膠回收的方法回收產(chǎn)物，這樣利于降低假陽性。

• 若沒有合適酶切位點或者多次酶切制備線性化載體均不成功，可以選擇反向PCR擴(kuò)增，但不適合較大質(zhì)粒，如超過8 kb。
  

引物設(shè)計

• 目的片段引物設(shè)計：目的片段引物是由目的片段兩端序列加同源臂序列組成，同源臂長度設(shè)置在16-45 bp，Tm值在58–65°C。同源臂越長，有利于重組置換，但可能會影響目的片段擴(kuò)增；

• 載體引物設(shè)計：確定目的片段插入位置，推薦借助Snapgene軟件設(shè)計反向PCR引物。

PCR擴(kuò)增

• 反向PCR制備線性化載體及擴(kuò)增目的片段時需要使用高保真酶；

• 制備線性化載體后使用Dpn I內(nèi)切酶消化環(huán)狀質(zhì)粒模板，降低假陽性克隆。

插入片段與線性化載體摩爾比

• 10 µl 反應(yīng)體系，載體與插入片段總加入量建議在 0.01-0.3 pmol。插入片段與線性化載體的最佳摩爾比為 1:1-4:1；片段與片段的摩爾比為1:1。

• 推薦使用GenStar 克隆連接反應(yīng)體系計算工具，快速計算載體與目的片段使用量。

感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率

• 插入片段與載體全長超過10 kb，屬于長片段克隆，應(yīng)使用高效感受態(tài)；如：轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/μg DNA的感受態(tài)細(xì)胞。

• 感受態(tài)細(xì)胞與重組質(zhì)粒用量比例不小于10:1。

  
  

只要注意以上幾點，高效無縫克隆實驗輕松get。

什么？不清楚無縫克隆實驗具體怎樣操作？

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