Transwell小室共培養(yǎng)條件下內(nèi)皮細胞對成骨細胞增殖、凋亡的影響
實驗結(jié)果
1.MC3T3-E1/bEnd.3細胞共培養(yǎng)體系的建立
取復蘇后3 ~ 6 代生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞,胰酶消化制成單細胞懸液,進行細胞計數(shù),將細胞密度調(diào)整至2×105/mL后將1 mL 細胞懸液均勻接種于6孔板。利用孔徑0.4 µm 的Transwell小室建立非接觸的細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。
1、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細胞促進成骨細胞的增殖。
在共培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h、72 h 的4個時間點,對兩組MC3T3-E1細胞樣本進行CCK-8檢測(圖1)。從生長曲線可以看出,對照組和共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細胞的細胞活性均隨著時間延長而增加,但共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細胞的細胞活性增加更明顯,并且在共培養(yǎng) 48 h 和 72 h 兩個時間點兩組差異有統(tǒng)計學意義 (P < 0.05)。
PI 單染流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果表明 ,與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1 細胞周期中 3 個時期的比例出現(xiàn)顯著變化。
Western blotting 的結(jié)果證實 ,與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1 細胞的 PCNA 蛋白表達水平顯著升高 (P < 0.01),表明 MC3T3-E1細胞的增殖能力較對照組顯著增強。
2、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細胞抑制成骨細胞的凋亡 。
Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞檢測結(jié)果表明 (圖 4),與bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1細胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05)。
與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1細胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05)。采用 Westernblotting 檢測凋亡相關(guān)因子 Bax、Cleaved Caspase-3的表達變化 ,結(jié)果顯示,與對照組相比,共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細胞 Bax、Cleaved Caspase-3 的表達水平顯著降低 (P<0.05)。
上述結(jié)果顯示,在Transwell 共培養(yǎng)條件下,bEnd.3 能夠抑制 MC3T3-E1 細胞的凋亡。
本 研 究 利 用 Transwell 小 室 , 構(gòu) 建 bEnd.3/MC3T3-E1 共培養(yǎng)體系。研究表明,在 Transwell 小室共培養(yǎng)條件下,微血管內(nèi)皮細胞 bEnd.3 能夠顯著促進成骨細胞MC3T3-E1 的增殖,并抑制其凋亡。這為防治骨質(zhì)疏松、構(gòu)建血管化組織工程骨選擇合適的微血管內(nèi)皮細胞提供了理論依據(jù),并進一步加深了微血管內(nèi)皮細胞對成骨細胞功能調(diào)控的理解。
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