Transwell小室共培養(yǎng)條件下內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.MC3T3-E1/bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立
取復(fù)蘇后3 ~ 6 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞,胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至2×105/mL后將1 mL 細(xì)胞懸液均勻接種于6孔板。利用孔徑0.4 µm 的Transwell小室建立非接觸的細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。
1、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。
在共培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h、72 h 的4個(gè)時(shí)間點(diǎn),對(duì)兩組MC3T3-E1細(xì)胞樣本進(jìn)行CCK-8檢測(cè)(圖1)。從生長(zhǎng)曲線可以看出,對(duì)照組和共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞活性均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞活性增加更明顯,并且在共培養(yǎng) 48 h 和 72 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P < 0.05)。
PI 單染流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明 ,與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1 細(xì)胞周期中 3 個(gè)時(shí)期的比例出現(xiàn)顯著變化。
Western blotting 的結(jié)果證實(shí) ,與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1 細(xì)胞的 PCNA 蛋白表達(dá)水平顯著升高 (P < 0.01),表明 MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組顯著增強(qiáng)。
2、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制成骨細(xì)胞的凋亡 。
Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明 (圖 4),與bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05)。
與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后,MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05)。采用 Westernblotting 檢測(cè)凋亡相關(guān)因子 Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)變化 ,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞 Bax、Cleaved Caspase-3 的表達(dá)水平顯著降低 (P<0.05)。
上述結(jié)果顯示,在Transwell 共培養(yǎng)條件下,bEnd.3 能夠抑制 MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡。
本 研 究 利 用 Transwell 小 室 , 構(gòu) 建 bEnd.3/MC3T3-E1 共培養(yǎng)體系。研究表明,在 Transwell 小室共培養(yǎng)條件下,微血管內(nèi)皮細(xì)胞 bEnd.3 能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1 的增殖,并抑制其凋亡。這為防治骨質(zhì)疏松、構(gòu)建血管化組織工程骨選擇合適的微血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了理論依據(jù),并進(jìn)一步加深了微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞功能調(diào)控的理解。
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