植物生長發(fā)育需要多種營養(yǎng)和生長調(diào)節(jié)物質(zhì),當(dāng)其缺乏時,生長發(fā)育受阻,形態(tài)不正常。在植物組織快繁過程中,培養(yǎng)物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)和生長因子,主要靠培養(yǎng)基供給。因此,*培養(yǎng)基的成分除了水分外,還要包括無機(jī)營養(yǎng)、有機(jī)物營養(yǎng)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其他附加物等。
一、無機(jī)營養(yǎng)物
無機(jī)營養(yǎng)物即無機(jī)鹽是植物生長發(fā)育所必需的,根據(jù)植物對無機(jī)鹽需要的多少,將其分為大量元素和微量元素。
1. 大量元素
大量元素在植物體內(nèi)含量占干物重的0.1-10%,其濃度一般大于0.5mmol/L,包括氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、硫(S),若加上碳(C)、氫(H)、氧(O),則有9種元素。在離體培養(yǎng)中,其C、H、O三元素是從人工加入的糖類獲得的,H、O元素也可以從培養(yǎng)基所含的水分中獲得,而其余6種礦質(zhì)元素要從加入的適量的無機(jī)鹽類來獲取。無機(jī)氮常以硝態(tài)氮(如KNO3)和銨態(tài)氮(如NH4NO3)兩種形式供應(yīng),多數(shù)培養(yǎng)基都是二者兼而有之。
2. 微量元素
植物所需的微量元素包括鐵(Fe)、硼(B)、錳(Mn)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鉬(Mo)、氯(Cl)等,植物對其需要量極微,在植物體內(nèi)含量占干物重的0.01%以下,起生長發(fā)育所需的濃度一般小于0.5mmol/L,稍多則產(chǎn)生毒害。碘(I)雖不是植物生長的必需元素,但幾乎在所有的培養(yǎng)基中都含有碘元素,有些培養(yǎng)基還加入了鈷(Co)、鎳(Ni)、鈦(Ti)、鈹(Be),甚至鋁(Al)等元素。
3. 鐵鹽
鐵是用量較多的一種微量元素,是許多重要氧化還原酶的組成成分,在植物葉綠素的合成過程中起到重要的作用。若以硫酸鐵和氯化tie為供鐵源,培養(yǎng)基的pH值會達(dá)到5.2以上,形成氫氧化鐵沉淀,使培養(yǎng)物無法吸收而出現(xiàn)缺鐵癥,故在培養(yǎng)基配制時,常用硫酸亞鐵和EDTA二鈉配成螯合態(tài)鐵,成為有機(jī)態(tài)鐵方被培養(yǎng)物吸收和利用;也可用EDTA鐵鹽,作為鐵的供應(yīng)源。
這些元素參與培養(yǎng)物機(jī)體的建造,構(gòu)成植物細(xì)胞中的核酸、蛋白質(zhì)、葉綠體、酶系統(tǒng)和生物膜所必需的元素。
二、有機(jī)營養(yǎng)成分
在配制培養(yǎng)基時,不僅要加入無機(jī)營養(yǎng)成分,還要加入一定量的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì),以利于培養(yǎng)物的生長和分化。
1. 糖類
在組織快繁中,被培養(yǎng)的培養(yǎng)物大多不能進(jìn)行光合作用,能進(jìn)行的也不能滿足其對糖類的需求,因此必須在培養(yǎng)基中添加糖作為碳源和能源,同時對維持培養(yǎng)基一定的滲透壓也有重要作用。
最重要的碳源是蔗糖,其濃度一般為2%-3%。葡萄糖和果糖也是較好的碳源。在大規(guī)模工廠化生產(chǎn)中,為了降低生產(chǎn)成本,可用市售的白砂糖代替蔗糖,也有同樣的效果。
2. 維生素
維生素常以輔酶形式參與生物催化劑——酶系的活動,以及參與細(xì)胞的蛋白質(zhì)代謝、脂肪代謝、糖代謝等重要生命活動。在組培中以B族維生素為主,常使用鹽酸硫胺素(維生素B1)、鹽酸吡哆醇(維生素B6)、煙酸(維生素B3)、鈷胺素(維生素B12)、葉酸(維生素Bc)、生物素(維生素H)、抗壞血酸(維生素C)等,一般使用濃度為0.1-1.0mg/L。
3. 肌醇(環(huán)己六醇)
在組培中,肌醇本身不直接促進(jìn)培養(yǎng)物的生長,可有助于活性物質(zhì)作用的發(fā)揮,提高維生素B1的效果,參與碳水化合物代謝、磷脂代謝和離子平衡作用,從而促進(jìn)培養(yǎng)物的生長和胚狀體及芽的形成。在配制培養(yǎng)基時,肌醇通常使用濃度為50-100mg/L。
4. 氨基酸
在培養(yǎng)基中要加入一種或數(shù)種氨基酸,最常使用的是甘氨酸(Gly),有時用到絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)等,作為重要的有機(jī)氮源。甘氨酸能促進(jìn)離體根的生長,對其培養(yǎng)物的生長也有良好的促進(jìn)作用,通常用量為2-3mg/L。有時也采用水解乳蛋白(LH)或水解絡(luò)蛋白(CH),它們是牛乳用酶法等加工而成的水解產(chǎn)物,是含有約20種氨基酸的混合物,通常用量為500mg/L。
5. 有機(jī)附加物
在組培中,人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加一些天然的有機(jī)物或提取物對培養(yǎng)物的增殖和分化有明顯的促進(jìn)作用。例如椰乳(CM),一般用量為10%-20%(或100-150mg/L);酵母提取物為0.5%;番茄汁為5%-10%;香蕉泥為100-200mg/L;馬鈴薯用量為150-200g/L,去皮和去芽后,煮30分鐘,再過濾,即可加入培養(yǎng)基中。馬鈴薯、香蕉泥具有較大的pH緩沖作用。這些天然有機(jī)物的作用是為培養(yǎng)物提供一些必要的營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素等。但由于這些天然有機(jī)物成分較復(fù)雜,且難確定,含量又不穩(wěn)定,所以應(yīng)盡量避免使用。
三、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)
在組培中,為了促進(jìn)培養(yǎng)物生長和器官分化,其培養(yǎng)基除加入營養(yǎng)物質(zhì)外,還必須加入一種或多種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(植物激素)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì),在組培中起著決定的作用。一般常用生長素和細(xì)胞分裂素類。
1. 生長素類
生長素類常用的有吲哚乙酸(IAA)、吲哚d酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯b氧乙酸(2,4-D),它們的作用強(qiáng)弱順序為2,4-D > NAA > IBA > IAA。其中IAA為天然植物生長素,它易見光分解,不穩(wěn)定,故應(yīng)避光置于棕色瓶中,放于4-5℃下保存。NAA、IBA、2,4-D都是人工合成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì),即穩(wěn)定又廉價。2,4-D一般用于初代培養(yǎng),啟動細(xì)胞脫分化,而再分化階段往往不用2,4-D,而用NAA、IBA、IAA。在生根誘導(dǎo)中一般多用IBA,試驗證明ABT生根粉誘導(dǎo)生根效果也很好。
組培中,生長素類的作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成,胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根,更重要的是細(xì)胞分裂素配成一定的比例誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生。
2. 細(xì)胞分裂素類
細(xì)胞分裂素類常用的有:激動素(KT)、6-芐氨基嘌呤(6-BA/BA/BAP)、玉米素(ZT)、2-異戊烯腺嘌呤(2-ip)、吡效隆(4PU/CPPU)和噻重氮苯基脲(TDZ)。他們對培養(yǎng)物的作用強(qiáng)弱順序為TDZ、4PU > 2-ip > 6-BA > KT。但在組培中通常使用人工合成的6-BA和KT,因他們性能穩(wěn)定且價格適中。
細(xì)胞分裂素類的作用主要有:促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大;抑制莖的伸長,而使莖增粗;解除頂端優(yōu)勢,誘導(dǎo)芽的分化,促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā);增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成,延緩組織的衰老。
在進(jìn)行組培中,常將細(xì)胞分裂素和生長素配合使用,用Skoog等(1957)建立的“器官分化激素配比模式”,指導(dǎo)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生產(chǎn)中的應(yīng)用,即細(xì)胞分裂素與生長素的比例大時,促進(jìn)芽的形成,這時細(xì)胞分裂素起到主導(dǎo)作用;比例小時,則有利于根的形成,這時生長素起主導(dǎo)作用。培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素與生長素之間的比例是決定器官分化的關(guān)鍵。
四、瓊脂
依據(jù)態(tài)相不同,培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基,其區(qū)別在于加入瓊脂與否,若加入瓊脂便形成膠體狀態(tài)的固體培養(yǎng)基,而不加則為液體培養(yǎng)基。瓊脂是固化劑,他是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物,在培養(yǎng)基中本身不具營養(yǎng),它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固,一般使用量為0.6-1.0%。培養(yǎng)基的pH值偏酸,高壓滅菌時間過長,溫度過高均會影響其凝固力。瓊脂一般以色淺、透明、潔凈為好,新買來的瓊脂要先試驗一下它的凝固能力,以便確定其適宜的用量。
五、活性炭
在培養(yǎng)基中加入活性炭(AC),其目的主要是利用其吸附能力,減少一些有害物質(zhì)的不利影響,同時也創(chuàng)造暗環(huán)境,對某些植物誘導(dǎo)生根有利。一般認(rèn)為活性炭之所以有強(qiáng)大的吸附能力,主要是通過氫鍵、范德華力等作用力,把有毒物質(zhì)從外植體周圍吸附掉?;钚蕴砍擞形阶饔猛?,在一定程度上還降低光照強(qiáng)度,從而減輕褐變。但是,活性炭對物質(zhì)的吸附無選擇性,既吸附有毒酚類的同時,又吸附培養(yǎng)基中的有利物質(zhì),如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、維生素B6、葉酸、煙酸等,并且在不同植物的組培中有效程度不一。因此,在決定使用活性炭時應(yīng)先試驗再確定是否采用,通常使用濃度0.1%-0.5%。
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